Los enteroides son organoides tridimensionales derivados de células epiteliales intestinales. Son ideales para el estudio de interacciones fisiológicas complejas, señalización celular y defensa de patógenos del huésped. Nuestro protocolo describe cómo cultivar enteroides humanos después de aislar las células madre intestinales de pacientes sometidos a resección intestinal.
La administración conjunta de lipopolisacárido en nuestros medios de cultivo provoca una respuesta inflamatoria en los enteroides que conduce a alteraciones histológicas, genéticas y de expresión de proteínas similares a las observadas en la enterocolitis necrotizante humana. Dado que el estudio de la enterocolitis necrotizante y los posibles agentes terapéuticos es éticamente desafiante en sujetos humanos, especialmente en niños, es altamente deseable utilizar este modelo enteroides novedoso y biológicamente relevante de enterocolitis necrotizante utilizando tejido neonatal humano. La principal ventaja de esta técnica es que los enteroides son capaces de recapitular los múltiples tipos de células del epitelio intestinal humano y son capaces de superar las limitaciones reconocidas de los modelos animales y sistemas basados en células.
Ayudar a demostrar el procedimiento será Christie Buonpane, una residente quirúrgica, y Carrie Yuan, una técnica de laboratorio de nuestro laboratorio. En el momento de la recolección en la suite operativa, coloque la pequeña muestra de tejido intestinal humano en DPBS frío. Lave la muestra en el DPBS frío hasta que esté libre de sangre y heces.
Almacene la muestra en EL medio RPMI 1640 a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para el aislamiento de la cripta. Cuando esté listo para proceder, compruebe de nuevo que el espécimen está libre de heces y sangre. El uso de delicadas tijeras disección eliminar cualquier exceso de grasa o grapas quirúrgicas.
Peso de la muestra y apuntar a una pieza que es aproximadamente 0.75 a 2.5 gramos. A continuación, corte el tejido en trozos de 0,5 centímetros y colóquelos en un tubo que contenga 30 mililitros de tampón quelante número uno. Agitar a baja velocidad durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.
Luego, filtre el tejido a través de un colador celular de 100 micrómetros y deseche el flujo a través. Agregue el tejido filtrado a un tubo que contenga 30 mililitros de tampón quelante número dos. Agitar a baja velocidad durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.
Filtre el tejido a través de un filtro de 100 micrómetros y deseche el flujo. Después de esto, descongelar 500 microlitros de la matriz de membrana del sótano en el hielo para su uso posterior. Agregue un poco de tejido a 10 mililitros de DMEM frío en un tubo cónico de 50 mililitros y agite vigorosamente a mano durante 10 segundos.
Filtrar esta suspensión a través de un colador celular de 100 micrómetros y recoger el flujo a través. Mantén este tubo en hielo. Agregue un poco de tejido a otros 10 mililitros de DMEM frío en un tubo cónico separado de 50 mililitros y agítelo vigorosamente a mano durante 10 segundos.
Filtrar esta suspensión a través de un colador celular de 100 micrómetros y recoger el flujo a través. Repita el proceso dos veces adicionales hasta que haya cuatro tubos cónicos que contengan flujo a través de la etiqueta de uno a cuatro. A continuación, filtre la solución en el tubo número uno a través de un colador celular de 100 micrómetros y transfiera el flujo a través de un tubo cónico de 15 mililitros también etiquetado como el número uno.
Repita este proceso para los tubos del dos al cuatro. Centrifugar los tubos de 15 mililitros a 200 veces G y a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. En la campana de flujo laminar, retire el sobrenadante de cada tubo y deséchelo.
Evite interrumpir la nube de tejido inmediatamente por encima del pellet, incluso si eso significa dejar atrás a un sobrenadante. En cada tubo, pipetee hacia arriba y hacia abajo lentamente para mezclar el pellet con el sobrenadante sobrante. Transfiera la mezcla de cada tubo a un solo tubo cónico de dos mililitros y centrífuga a 200 veces G y a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.
Después de esto, retire el sobrenadante y resuspendir el pellet en 500 microlitros de matriz de membrana de sótano pre-descongelada. Utilice una punta de pipeta refrigerada para aplicar 50 microlitros de esta suspensión en el centro de un pozo en una placa de 24 pozos. Esta muestra debe tener forma de cúpula.
Repita este proceso de solicitud nueve veces para llenar 10 pozos totales. Transfiera la placa de 24 pozos a una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante 30 minutos para permitir la polimerización. A continuación, agregue 500 microlitros de medios minigut humanos completos a cada pozo.
Continúe incubando en las mismas condiciones, asegurándose de reemplazar este medio cada dos días. En primer lugar, añadir 10 microlitros de LPS a una concentración de cinco miligramos por mililitro a los 500 microlitros de medios minigut humanos completos en cada pozo de la placa en el día cero. Continúe incubando a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y reemplace los medios suplementados cada dos días hasta su recolección.
Para preparar la incrustación de parafina, primero retire suavemente el medio, agregue un mililitro de PBS y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para disolver la matriz de membrana del sótano mientras tenga cuidado de no alliceerar los enteroides. Centrifugar a una velocidad inferior a 300 veces G durante cinco minutos para peletizar y luego retirar el PBS. Añadir 4%paraformaldehído y dejar el tubo a un lado durante una hora para fijar a temperatura ambiente.
Centrifugar a una velocidad inferior a 300 veces G durante cinco minutos para el pellet y luego eliminar el paraformaldehído. Lavar suavemente con un mililitro de PBS y centrífuga a una velocidad inferior a 300 veces G durante cinco minutos. A continuación, quite el PBS.
Repita este proceso de lavado con PBS una vez. Coloque la cantidad deseada del gel de procesamiento de tejido en un tubo cónico y caliente en una incubadora de baño seco a 65 grados Celsius durante tres a 10 minutos hasta que esté líquido. Después de esto, agregue el gel de procesamiento de tejido fundido al pellet y mezcle suavemente.
Coloque un pequeño anillo de clonación en un cubreobjetos. Pipetear el gel de procesamiento de tejido y la mezcla enteroides en el anillo de clonación que se monta en un cubreobjetos. Deje que el gel de procesamiento de tejido y la mezcla enteroides se solidifican a cuatro grados Cent durante una hora.
A continuación, sumerja el anillo de clonación con la mezcla solidificada en 70% etanol para prepararse para la incrustación de parafina. Inmediatamente después del enchapado, las criptas intestinales recién aislantes aparecen como varillas alargadas. En cuestión de horas los enteroides tendrán una apariencia redonda.
Durante los próximos días los enteroides comenzarán a formar esferas. El ensojo debe ocurrir entre cinco y 10 días, que es cuando se debe producir la recolección enteroides. Los enteroides en crecimiento también exhiben polaridad, que contiene un lumen centralizado, un borde apical y un dominio basilateral.
Los enteroides también muestran integridad estructural representada por un citoesqueleto de actina robusto. Después de varios días en el cultivo, los enteroides tratados con LBS experimentan más apoptosis y tienen un rendimiento menor que el grupo de control. Como se ve en nec humana en modelos murinos de NEC, una mayor expresión de peaje como el receptor cuatro se encuentra en enteroides tratados CON LPS en comparación con los controles.
Los enteroides también se pueden recolectar para la extracción de ARN y proteínas utilizando qRT-PCR bien establecido y se pueden realizar técnicas de hinchazón occidental y aislamiento de proteínas.
