Las consecuencias de las mutaciones en la expresión génica a menudo se evalúan cualitativamente mediante hibridación in situ y generalmente se puntúen visualmente, lo cual es subjetivo y sesgado por las expectativas del investigador. Este método proporciona una manera más coherente de comparar experimentos in situ cuantificando las intensidades de la imagen y elimina ese sesgo. Esto también se puede adaptar fácilmente a otros sistemas modelo que utilizan la hibridación in situ como lector de una expresión génica.
Comience por tomar imágenes de los embriones manchados de hibridación in situ o DE ISH. Preparar una solución de glicerol y mezclarla para homogeneizarla. Transfiera los embriones a la solución de glicerol con una pipeta Pasteur de tres mililitros y déjelos reposar durante al menos cinco minutos.
Preparar y etiquetar suficientes tubos de PCR para transferir los embriones manchados de ISH después de la toma de imágenes, luego utilice una pipeta Pasteur de tres mililitros para agregar 100% glicerol al fondo del pozo de un portaobjetos de depresión de vidrio. Transfiera un único embrión manchado de ISH a la corredera de vidrio y orientelo bajo un microscopio estéreo equipado con una cámara digital y una iluminación inferior y superior. Con el primer embrión, ajuste el tiempo de iluminación y exposición con el aumento deseado.
Imagen de tantos embriones como sea necesario y etiqueta cada imagen con un número único. Después de la toma de imágenes, transfiera cada embrión a un tubo de PCR etiquetado con el mismo número y, si es necesario, aspire el exceso de glicerol de los tubos de PCR. Para extraer el ADN, añada de 40 a 75 microlitros de un tampón de lelisis alcalina como HoTSHOT a cada tubo.
Incubar los tubos a 95 grados centígrados durante aproximadamente 30 minutos y luego enfriarlos a cuatro grados centígrados. Añadir un volumen igual de tampón de neutralización y proceder con el genotipado para la mutación de interés. Para realizar el análisis de imágenes, seleccione y abra la imagen en Fiji e invierta haciendo clic en Editar y, a continuación, en Invertir, luego convierta el tipo de imagen a 8 bits haciendo clic en la pestaña Imagen, seleccionando Tipo y seleccionando 8 bits.
Seleccione la herramienta poligonal y dibuje manualmente la región de interés o ROI en la imagen alrededor de la región que contiene la señal ISH que se va a medir. Presione T para abrir el Administrador de ROI y seleccione la región de interés y, a continuación, haga clic en Medir. Copie el valor medio de la ventana Resultados en una hoja de cálculo.
Para medir la intensidad de fondo, mueva el ROI a una región del embrión sin manchas y haga clic en Agregar en el Administrador de ROI. Seleccione la región de fondo y haga clic en Medir y, a continuación, registre el valor de intensidad media en la hoja de cálculo. Obtenga la intensidad media del píxel de la señal de hibridación NC2 restando la intensidad media del fondo de la de la región manchada.
Después de determinar la intensidad media de cada muestra, asigne un genotipo a cada muestra. Si no se puede determinar el genotipo, excluya la muestra del análisis posterior. Ordene los valores medios de intensidad de la muestra según el genotipo y continúe con las pruebas estadísticas.
La utilidad de esta técnica se ha demostrado en ISH para dnmt3bb. 1 en embriones de un incrucigous heterocigoto runx1. Una disminución en dnmt3bb.
Se detectó 1 expresión en mutantes homocigotos runx1, mientras que los embriones heterocigotos no mostraron diferencias significativas en dnmt3bb. 1 expresión. Al intentar determinar el efecto de la mutación lmo4 en la expresión runx1, este análisis no mostró diferencias significativas en la expresión entre el tipo salvaje y los mutantes lmo4 homocigotas.
Sin embargo, una pequeña disminución de la expresión runx1 fue detectada por un solo embrión qPCR. En aproximadamente el 0,4% de los embriones con sonda runx1, la ISH tenía un fondo alto que resultó en un número negativo cuando se restó de la señal. En tales casos, los embriones fueron excluidos del análisis.
Cuatro regiones diferentes en los embriones han sido probadas para optimizar las correcciones de fondo. Si bien hubo una diferencia relativamente estable en la intensidad del ROI en cualquiera de las áreas de fondo, R3 siempre mostró una intensidad más alta que el ROI y no debe utilizarse para la corrección de fondo. R1 y R4 demostraron ser las áreas más apropiadas para la corrección de fondo.
Es importante encontrar las mejores condiciones para la toma de imágenes y mantenerlas sin cambios durante todo el experimento. También recomendamos cuantificar la intensidad del píxel antes de asignar un genotipo a cada muestra.
