この方法は、細胞周期依存治療効果に関する情報を提供し、細胞増殖とDNA損傷に対する対処機構の相互作用を可能にし、深く研究する。この方法は、二本鎖のフラグ認識と修復、細胞周期効果、アポトーシスによる最終的な細胞死を含むDNA損傷応答からの重要なエンドポイントを1つの包括的なアッセイに組み合わせたものです。我々は、臨床腫瘍学における放射線化学療法治療の特定の治療応答および副作用を主に調査するためにこの技術を用いてきた。
このアッセイは、放射線生物学と放射線療法の分野における相関研究に非常に有用であるが、腫瘍学の他の様々な分野にも適用することができる。標準的な細胞採取手順に従って培養液から細胞を採取した後、PBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁する。そして、ボンネット内の固定溶液の2ミリリットルに細胞を移す。
室温で10分間のインキュベーションを行った後、遠心分離により細胞を回収し、上清をデカントする。細胞を単一の細胞懸濁液として固定し、すべてのサンプルの固定時間を一定に保つことが重要です。接着細胞に、分析のために丸みを帯びた細胞を得るために取り外すのに十分な時間を与える。
その後、70%エタノールの3ミリリットルで細胞をタップし、再懸濁させてペレットを緩めます。染色前に細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈め、タップしてペレットを緩める。その後、3ミリリットルの洗浄液で2回連続洗浄し、1ミリリットルの洗浄液で1回洗浄して細胞を再懸濁します。
各洗浄の間に上清を捨てる。最後の洗浄後、ペレットを邪魔することなく上清を慎重に吸引し、目的の抗体カクテルの100マイクロリットルで発光ペレットを再懸濁する。室温で1時間後、遠心分離により細胞を採取し、ペレットを乱すことなく上清を慎重に吸引する。
次に、100~250マイクロリットルのDNA染色液で緩んだペレットを再懸濁し、35マイクロメートルのメッシュ細孔サイズのサンプルチューブの細胞ストレーナーキャップを通して細胞を分配する。フローサイトメトリーでセルを解析するには、サイトメーターウィンドウのパラメータタブを開き、表に示されているパラメータを選択します。次に、ワークシート ウィンドウを開き、示されているとおりにプロットを作成します。
コントロールサンプルをサイトメーターにロードし、実行ボタンを押します。ブラウザ ウィンドウで最初のチューブを選択し、チューブ名をクリックします。インスペクターウィンドウのパラメータタブで、前方およびサイドスキャッタとDAPIの検出器電圧を調整します。
スタンバイボタンを押して、ソフトウェアのワークシートの設定を続行します。ポリゴン ゲート ツールを使用して、前方散布領域と側面散布領域プロットのセルの母集団を定義し、矩形ゲート ツールを使用して DAPI と DAPI エリア プロットを使用する単一セルの母集団を定義します。コントロール G を押して人口階層を表示し、デフォルトのゲート名をクリックして名前を変更します。
続いて、すべてのヒストグラムを右クリックして、コンテキストメニューから表示母集団と単一セルを選択します。制御および処理されたサンプルを取得して、抗体結合フルオロフォアの検出電圧を最適化し、信号の全ダイナミックレンジをカバーします。サンプルを測定するには、サイトメーターの実行ボタンを押し、ソフトウェアの取得ダッシュボードを使用してサンプルを測定します。
次に、ファイル、エクスポート、および実験を選択してダイアログボックスでディレクトリのエクスポートを選択し、データをドットFCSファイルとして保存します。データを評価するには、ドット FCS ファイルをフロー サイトメトリック解析ソフトウェアのサンプル ブラウザにドラッグ アンド ドロップします。また、ポリゴン ツールを使用して、前方散布図と側面散布図でのセルの母集団を定義し、解析から破片を除外します。
DAPI と DAPI 領域プロットでは、矩形ツールを使用して単一セルの母集団を定義し、セルの二重または束を解析から除外します。DAPI領域ヒストグラムでは、二等分法ツールを使用して、正常なDNA含量を有する単一細胞と分解されたDNAを有するアポトーシス細胞とを区別します。ツール生物学と細胞周期を選択して細胞周期モデリングツールを開き、ディーン・ジェットフォックスを選択してG 1 SおよびG 2 M相の細胞の頻度を推定します。
G 1 S と G 2 と M の位相ゲートを、セル周期母集団の DAPI 面積プロットと対 DAPI エリア プロットで作成し、セル周期特異的ガンマ H 2 A X 測定を可能にします。二等分法ツールを使用して、細胞周期母集団のAlexa 555領域ヒストグラムにおけるホスホヒストンH 3個の正および負の細胞を区別し、単一細胞の母集団のAlexa 647領域の3つの正および負の細胞をCASベースに区別します。コントロール T を押してテーブルエディタを開き、指示に示されたとおりにテーブルを設定します。
次に、[ファイル] を選択して、メニュー リボンの出力セクションで形式と出力先を設定し、データをスプレッドシート にエクスポートします。炭素イオンは、同じ物理的線量の光子放射と比較して、よりゆっくりと減少し、24〜48時間で有意に上昇したままの神経膠芽腫細胞において、より高いガンマH 2 AXピークレベルを誘導する。炭素イオンと光子放射の両方について、ガンマH2 AXレベルは、DNA二重鎖破断修復が細胞周期のこの段階で結合する非相同端の経路に限定されるため、G1相細胞で最も高かった。
二重鎖破断誘導率の上昇と修復運動の遅れに合わせて、炭素イオンは、G 2相でより強く、より長く持続する細胞周期の逮捕を誘導し、光子よりも高いアポトーシス率を誘導する。治療効果の強さに応じて、異なる細胞周期相の分解能は困難な場合があります。一部の細胞株では、DAPI濃度は細胞周期プロファイルの品質に大きな影響を与え、調整する必要があります。
フローサイトメトリー後の残りのサンプルからスライドを作成して、ガンマH 2 AX病巣の数、大きさ、形状を評価し、焦点とパル核ガンマH 2つのAX染色を区別することができます。我々の方法を用いて、間葉系幹細胞は電離放射線およびトポイソメラーゼ阻害に対して比較的耐性であるが、グリオミヤシンに対して感受性であることを示すことができる。PFAの煙は有毒であるので、固定液を準備するときおよび固定段階の間に常にヒュームフードを使用する。
また、DAPIを扱うときに手袋を着用することを忘れないでください。
