Метод предоставляет информацию о клеточном цикле зависимых эффектов лечения и позволяет и углубленное изучение взаимодействия между клеточным распространением и механизмы борьбы с повреждением ДНК. Этот метод сочетает в себе важные конечные точки от реакции повреждения ДНК, включая двойное распознавание и ремонт frag, эффекты клеточного цикла, и в конечном итоге гибель клеток от апоптоза в один всеобъемлющий анализ. Мы использовали этот метод в основном для изучения конкретных ответов лечения и побочных эффектов радиохимиотерапевтического лечения в клинической онкологии.
Анализ очень полезен для коррелятивных исследований в области радиобиологии и лучевой терапии, но он также может быть применен к различным другим областям онкологии. После сбора клеток из культуры в соответствии со стандартными процедурами сбора клеток, повторно использовать гранулы в один миллилитр PBS. И передать клетки в два миллилитров фиксации раствора в капюшоне.
После 10-минутной инкубации при комнатной температуре собирайте клетки путем центрифугации и высасывляя супернатант. Важно зафиксировать клетки как одноклеточную подвеску, и сохранить время фиксации постоянным для всех образцов. Дайте адепту клетки достаточно времени, чтобы отделиться, чтобы получить красиво округлые клетки для анализа.
Затем ослабить гранулы, нажав и повторного использования клеток в три миллилитров 70% этанола. Чтобы вымыть клетки перед окрашиванием, осадок клеток центрифугации, и ослабить гранулы, нажав. Затем повторно помыть клетки с двумя последовательными моет с тремя миллилитров стирального раствора и один мыть с одним миллилитров стирального раствора.
Отказ от супернатанта между каждой стиркой. После последнего мытья, тщательно аспирировать супернатант, не нарушая гранулы и повторно люцерна гранулы в 100 микролитров антител коктейль интерес. После одного часа при комнатной температуре, собирать клетки центрифугации и тщательно аспирировать супернатант, не нарушая гранулы.
Затем, resuspend ослабил гранулы в 100 до 250 микролитров раствора окрашивания ДНК и обойтись клетки через крышку клетки ситечко образца трубки с 35 микрометровой сетки поры размера. Чтобы проанализировать клетки по цитометрии потока, откройте вкладку параметров в окне цитометра и выберите параметры, указанные в таблице. Затем откройте окно листа и создайте участки, как указано.
Загрузите образец управления на цитометр и нажмите кнопку запуска. Выберите первую трубку в окне браузера и нажмите на имя трубки. Отрегулируйте напряжение детектора для перемотки вперед и сбоку и DAPI в вкладке параметров окна инспектора.
Нажмите кнопку ожидания, чтобы продолжить настройку листа в программном обеспечении. Используйте инструмент полигонных ворот для определения популяции ячеек в области перегона по сравнению с участком области бокового рассеяния и используйте инструмент прямоугольных ворот для определения популяции отдельных ячеек в DAPI с участком области ДАПИ. Управление прессой G, чтобы показать иерархию населения и нажать на имена ворот по умолчанию, чтобы переименовать их.
Впоследствии нажмите правой кнопкой мыши на всех гистограммах, чтобы выбрать группы показов и отдельные ячейки из контекстового меню. Приобрети контрольные и обработанные образцы для оптимизации напряжения детектора для флюорофоров, связанных с антителами, чтобы покрыть весь динамический диапазон сигнала. Для измерения образцов нажмите кнопку запуска на цитометре и используйте приборную панель приобретения в программном обеспечении для измерения образцов.
Затем выберите файл, экспорт и эксперименты для выбора экспорта каталогов в диалоговом поле для сохранения данных в качестве точечных файлов FCS. Чтобы оценить данные, перетащите и уроните точечные файлы FCS в образец браузера программного обеспечения цитометрического анализа потока. И используйте полигон инструмент для определения популяции клеток в форварде по сравнению с боковым участком рассеяния и исключения мусора из анализа.
В daPI с участком области по сравнению с DAPI используйте прямоугольный инструмент для определения популяции одиночных ячеек и исключения из анализа любых дублетов или комков клеток. В гистограмме области DAPI используйте бизекторный инструмент для различения одиночных клеток с нормальным содержанием ДНК от апоптотических клеток с деградированной ДНК. Выберите биологию инструментов и клеточный цикл, чтобы открыть инструмент моделирования клеточного цикла и выберите Dean-Jett Fox для оценки частоты клеток в G one S и G двух фазах M.
Создайте G один S и G два и M фазы ворот в DAPI с по сравнению с DAPI области участка клеточного цикла населения, чтобы клеточный цикл конкретных гамма H два измерения X. Используйте инструмент бисектора, чтобы различать фосфохистон H три положительных и отрицательных клеток в Alexa 555 области гистограммы популяции клеточного цикла и различать CAS базы три положительных и отрицательных клеток в Alexa 647 области гистограммы популяции одной клетки. Управление прессой T, чтобы открыть редактор таблицы и настроить таблицу, как указано.
Затем выберите Файл для настройки формата и назначения в выходе раздела ленты меню и экспортировать данные в лист распространения. Углеродные ионы вызывают более высокие уровни гамма H два AX пик в клетках глиобластомы, которые снижаются медленнее и остаются значительно повышенными в 24 до 48 часов по сравнению с фотонным излучением в той же физической дозе. Как для ионов углерода, так и для фотон-излучения, гамма H два уровня AX были самыми высокими в G одной фазы клеток, вероятно, потому, что ДНК двойной нити перерыв ремонт ограничивается путь нехомологических конце присоединения на данном этапе в клеточном цикле.
В соответствии с более высокой двойной скоростью индукции разрыва нити и более медленным ремонтом кинетики, ионы углерода вызывают более сильный и более длительный арест клеточного цикла в фазе G two и более высокий уровень апоптоза, чем фотоны. В зависимости от силы эффекта лечения, разрешение различных фаз клеточного цикла может быть сложной задачей. В некоторых клеточных линиях концентрация DAPI оказывает большое влияние на качество профиля клеточного цикла и нуждается в корректировке.
Слайды могут быть подготовлены из оставшихся образцов после цитометрии потока для оценки количества, размера и формы гамма-H двух очагов AX и для различения фокусного и парнуклеарного гамма-H двух AX окрашивания. Используя наш метод, мы могли бы показать, что мезенхимальные стволовые клетки относительно устойчивы к ионизирующим излучениям и ингибированию топоизомеразы, но чувствительны к глиомяцину. Поскольку пары PFA токсичны, всегда используйте дымовой капот при подготовке раствора фиксации и во время шага фиксации.
Также не забудьте надеть перчатки при обработке DAPI.
