O método fornece informações sobre efeitos de tratamento dependentes do ciclo celular e permite e em profundidade o estudo da interação entre a proliferação celular e os mecanismos de enfrentamento contra danos ao DNA. Este método combina pontos finais importantes da resposta de dano de DNA, incluindo reconhecimento e reparo de frag de dois fios, efeitos do ciclo celular e eventual morte celular por apoptose em um ensaio abrangente. Utilizamos essa técnica principalmente para investigar respostas específicas ao tratamento e efeitos colaterais de tratamentos radioquematerapêuticos em oncologia clínica.
O ensaio é muito útil para estudos correlativos nas áreas de radiobiologia e radioterapia, mas também pode ser aplicado a diversas outras áreas da oncologia. Depois de coletar as células da cultura de acordo com os procedimentos padrão de coleta celular, resuspensar a pelota em um mililitro de PBS. E transfira as células para dois mililitros de solução de fixação em um capô.
Após uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente, colete as células por centrifugação e decante o sobrenante. É importante fixar as células como uma única suspensão celular, e manter o tempo de fixação constante para todas as amostras. Dê às células aderentes tempo suficiente para se desprender para obter células bem arredondadas para análise.
Em seguida, solte a pelota tocando e resuspense as células em três mililitros de 70% de etanol. Para lavar as células antes da coloração, sedimentar as células por centrifugação, e afrouxar a pelota tocando. Em seguida, resuspenja as células com duas lavagens consecutivas com três mililitros de solução de lavagem e uma lavagem com um mililitro de solução de lavagem.
Descartando o supernaspeso entre cada lavagem. Após a última lavagem, aspire cuidadosamente o supernaente sem perturbar a pelota e resuspenda a pelota lucent em 100 microliters do coquetel de anticorpos de interesse. Após uma hora em temperatura ambiente, colete as células por centrifugação e aspire cuidadosamente o supernatante sem perturbar a pelota.
Em seguida, resuspenque a pelota solta em 100 a 250 microliters de solução de coloração de DNA e dispense as células através da tampa do filtro celular de um tubo de amostra com um tamanho de poros de malha de 35 micrômetros. Para analisar as células por citometria de fluxo, abra a guia de parâmetros na janela do citômetro e selecione os parâmetros conforme indicado na tabela. Em seguida, abra a janela da planilha e crie parcelas conforme indicado.
Carregue uma amostra de controle no citômetro e pressione o botão de execução. Selecione o primeiro tubo na janela do navegador e clique no nome do tubo. Ajuste as tensões do detector para dispersão para frente e lateral e DAPI na guia parâmetros da janela do inspetor.
Pressione o botão de espera para continuar com a configuração da planilha no software. Use a ferramenta do portão do polígono para definir a população das células na área de dispersão dianteira versus o enredo da área de dispersão lateral e use a ferramenta do portão de retângulo para definir a população de células únicas no dapi com o plot da área versus DAPI. Pressione o controle G para mostrar a hierarquia da população e clique nos nomes dos portais padrão para renomeá-los.
Posteriormente, clique com o botão direito do mouse em todos os histogramas para selecionar mostrar populações e células únicas do menu de contexto. Adquira amostras de controle e tratadas para otimizar as tensões do detector para os fluoroforos acoplados a anticorpos para cobrir toda a gama dinâmica de sinal. Para medir as amostras, pressione o botão de execução no citômetro e use o painel de aquisição no software para medir as amostras.
Em seguida, selecione arquivo, exportação e experimentos para selecionar a exportação do diretório na caixa de diálogo para salvar os dados como arquivos ponto FCS. Para avaliar os dados, arraste e solte os arquivos do ponto FCS no navegador de amostra do software de análise citométrica de fluxo. E use a ferramenta polígono para definir a população das células no enredo da área de dispersão dianteira versus lateral e para excluir detritos da análise.
No gráfico da área DAPI versus DAPI, use a ferramenta retângulo para definir a população de células únicas e para excluir quaisquer dobras celulares ou aglomerados da análise. No histograma da área da DAPI, use a ferramenta bisetor para distinguir células individuais com um conteúdo normal de DNA de células apoptóticas com DNA degradado. Selecione biologia de ferramentas e ciclo celular para abrir a ferramenta de modelagem do ciclo celular e selecione Dean-Jett Fox para estimar a frequência de células nas fases G one S e G two M.
Crie portões de fase G um S e G dois e M no traçado da área DAPI versus DAPI da população do ciclo celular para permitir uma medição de gama H específica de ciclo celular dois A X. Use a ferramenta bisetorial para distinguir o fosfohistone H três células positivas e negativas no histograma da área Alexa 555 da população do ciclo celular e para distinguir a base cas três células positivas e negativas no histograma da área Alexa 647 da população de células únicas. Pressione o controle T para abrir o editor da tabela e configure a tabela conforme indicado.
Em seguida, selecione Para Arquivar para definir o formato e o destino na seção de saída da fita do menu e exporte os dados para uma folha de propagação. Íons de carbono induzem maiores níveis de pico de gama H dois AX em células glioblastoma que declinam mais lentamente e permanecem significativamente elevados em 24 a 48 horas em comparação com a radiação de fótons na mesma dose física. Tanto para íons de carbono quanto para radiação de fótons, os dois níveis de AX gama H foram mais altos em células G uma fase provavelmente porque o reparo de quebra de fios duplos de DNA é limitado à via de extremidade nonhomologous juntando-se nesta fase no ciclo celular.
Em linha com a maior taxa de indução de quebra de fios duplos e cinética de reparo mais lenta, íons de carbono induzem uma prisão de ciclo celular mais forte e duradoura em fase G duas e uma taxa maior de apoptose do que os fótons. Dependendo da força do efeito do tratamento, a resolução das diferentes fases do ciclo celular pode ser desafiadora. Em algumas linhas celulares, a concentração de DAPI tem um grande impacto na qualidade do perfil do ciclo celular e precisa ser ajustada.
Slides podem ser preparados a partir das amostras restantes após a citometria de fluxo para avaliar o número, tamanho e forma de gama H dois focos AX e distinguir entre a coloração de gama H e parnuclear focal e parnuclear. Usando nosso método, poderíamos mostrar que as células-tronco mesenquimais são relativamente resistentes contra radiações ionizantes e inibição de topoisomerase, mas sensíveis à gliomyacina. Como os vapores PFA são tóxicos, use sempre um capuz de fumaça ao preparar a solução de fixação e durante a etapa de fixação.
Lembre-se também de usar luvas ao manusear DAPI.
