השיטה מספקת מידע על השפעות הטיפול תלוי מחזור התא ומאפשרת ולעומק מחקר של יחסי הגומלין בין התפשטות הסלולר ומנגנוני התמודדות נגד נזק לדנ"א. שיטה זו משלבת נקודות קצה חשובות מתגובת הנזק לדנ"א כולל זיהוי ותיקון של שבירה כפולת גדילים, השפעות מחזור התאים, ובסופו של דבר מוות תאי על ידי אפופטוזיס לתוך בדיקה מקיפה אחת. השתמשנו בטכניקה זו בעיקר כדי לחקור תגובות טיפול ספציפיות ותופעות לוואי של טיפולים radiochemotherapeutic באונקולוגיה קלינית.
ההתמדה שימושית מאוד למחקרים קואורלטיביים בתחומי הרדיוביולוגיה וההקרנות, אך ניתן ליישם אותה גם בתחומים שונים אחרים של אונקולוגיה. לאחר איסוף התאים מן התרבות על פי נהלי איסוף תאים סטנדרטיים, להשתמש מחדש את גלולה במיליליטר אחד של PBS. ולהעביר את התאים לשני מיליליטר של פתרון קיבעון בשכונה.
לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ו decant supernatant. חשוב לתקן את התאים כהשעיה של תא יחיד, ולשמור על זמן קיבוע קבוע עבור כל הדגימות. תן לתאים חסידים מספיק זמן להתנתק כדי להשיג תאים מעוגל יפה לניתוח.
ואז לשחרר את גלולה על ידי הקשה מחדש של התאים בשלושה מיליליטר של 70% אתנול. כדי לשטוף את התאים לפני הכתם, לעים את התאים על ידי צנטריפוגה, ולשחרר את גלולה על ידי הקשה. לאחר מכן בצעו שימוש חוזר בתאים עם שתי שטיפות רצופות עם שלושה מיליליטר של תות פתרון כביסה וכביסה אחת עם מיליליטר אחד של פתרון כביסה.
השלכת העל-טבעי בין כל שטיפה. לאחר הכביסה האחרונה, בזהירות שאפו את העל-טבעי מבלי להפריע לכדור והתינו מחדש את גלולת הלוקנט ב-100 מיקרוליטרים של קוקטייל הנוגדנים המעניין. לאחר שעה בטמפרטורת החדר, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה בזהירות לשאוף את supernatant מבלי להפריע גלולה.
לאחר מכן, תן שימוש חוזר את גלולה משוחררת ב 100 כדי 250 microliters של פתרון כתמי DNA ולחלק את התאים דרך מכסה מסננת התא של צינור מדגם עם גודל נקבובית רשת 35 מיקרומטר. כדי לנתח את התאים לפי ציטומטריית זרימה, פתח את לשונית הפרמטרים בחלון הציטומטר ובחר את הפרמטרים כפי שצוין בטבלה. לאחר מכן, פתח את חלון גליון העבודה וצור התוויות כמצוין.
טען דגימת בקרה על הציטרומטר ולחץ על לחצן הריצה. בחר את הצינור הראשון בחלון הדפדפן ולחץ על שם הצינור. כוונן את מתחי הגלאי עבור פיזור קדימה וצד ו- DAPI בכרטיסייה parameters של חלון המפקח.
לחץ על לחצן המתנה כדי להמשיך בהגדרת גליון העבודה בתוכנה. השתמש בכלי שער מצולע כדי להגדיר את אוכלוסיית התאים באזור פיזור קדימה לעומת ההתוויה של אזור פיזור הצד ולהשתמש בכלי שער המלבן כדי להגדיר את אוכלוסיית התאים הבודדים ב- DAPI עם התוויית אזור DAPI לעומת. לחץ על Control G כדי להציג את הירארכיית האוכלוסיה ולחץ על שמות השערים המוגדרים כברירת מחדל כדי לשנות את שמם.
לאחר מכן, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על כל ההיסטוגרמות כדי לבחור אוכלוסיות תצוגה ותאים בודדים מתפריט ההקשר. לרכוש דגימות בקרה וטופלו כדי לייעל את מתחי הגלאי עבור פלואורופורים מרוכזים בנוגדנים כדי לכסות את הטווח הדינמי המלא של האות. כדי למדוד את הדגימות, לחץ על לחצן ההפעלה בציטומטר ולהשתמש בלוח המחוונים של הרכישה בתוכנה כדי למדוד את הדגימות.
לאחר מכן בחר קובץ, ייצוא וניסויים לבחירת ייצוא ספריות בתיבת הדו-שיח כדי לשמור את הנתונים כקבצי FCS נקודה. כדי להעריך את הנתונים, גרור ושחרר את קבצי FCS של הנקודה בדפדפן לדוגמה של תוכנת הניתוח הציטומטרי של הזרימה. ולהשתמש בכלי מצולע כדי להגדיר את אוכלוסיית התאים בחלקת אזור פיזור קדימה לעומת צד ולהוציא פסולת מהניתוח.
ב- DAPI עם התוויית אזור DAPI לעומת, השתמש בכלי המלבן כדי להגדיר את האוכלוסיה של תאים בודדים ולא לכלול כפילויות או גושים של תאים מהניתוח. בהיסטוגרמה של אזור DAPI, השתמש בכלי ביסקטור כדי להבחין בין תאים בודדים עם תוכן דנ"א רגיל לתאי אפופוטוטיקה עם דנ"א מושפל. בחר ביולוגיה של כלי ומחזור תאים כדי לפתוח את כלי מידול מחזור התא ובחר דין-ג'ט פוקס כדי להעריך את תדירות התאים בשלבי G אחד S ו- G שני M.
צור G אחד S ו- G שני ו- M שערי שלב ב DAPI עם התוויית אזור לעומת DAPI של אוכלוסיית מחזור התא כדי לאפשר מחזור תא ספציפי גמא H שתי מדידת A X. השתמש בכלי bisector כדי להבחין בין phosphohistone H שלושה תאים חיוביים ושליליים בהיסטוגרמה של אזור Alexa 555 של אוכלוסיית מחזור התאים ולהבחין CAS בסיס שלושה תאים חיוביים ושליליים בהיסטוגרמה אזור Alexa 647 של אוכלוסיית התאים הבודדים. הקש Control T כדי לפתוח את עורך הטבלאות ולקבוע את תצורת הטבלה כפי שצוין.
לאחר מכן בחר באפשרות אל קובץ כדי להגדיר את התבנית והיעד במקטע הפלט של רצועת הכלים של התפריט ולייצא את הנתונים לגיליון כפולה. ions פחמן לגרום גמא גבוהה יותר H שתי רמות שיא AX בתאי גליובלסטומה לרדת לאט יותר ולהישאר גבוה באופן משמעותי ב 24 עד 48 שעות לעומת קרינת פוטון באותה מנה פיזית. עבור שני ions פחמן קרינת פוטון, גמא H שתי רמות AX היו הגבוהים ביותר בתאי שלב G אחד סביר כי תיקון שבירת גדיל כפול DNA מוגבל המסלול של סוף לא הומולוגי מצטרף בשלב זה במחזור התא.
בקנה אחד עם קצב אינדוקציה לשבור גדיל כפול גבוה יותר קינטיקה תיקון איטי יותר, יון פחמן לגרום מעצר מחזור תא חזק יותר וארוכת טווח ב G שני שלב וקצב גבוה יותר של אפופטוזיס מאשר לעשות פוטונים. בהתאם לעוצמת אפקט הטיפול, הרזולוציה של שלבי מחזור התא השונים יכולה להיות מאתגרת. בשורות תאים מסוימות, לריכוז DAPI יש השפעה גדולה על איכות פרופיל מחזור התא ויש להתאים אותו.
שקופיות ניתן להכין מן הדגימות הנותרות לאחר ציטומטריית זרימה כדי להעריך את המספר, גודל, ואת הצורה של גמא H שני מוקדי AX ולהבחין בין מוקד פרנוקלארי גמא H שני AX כתמים. בשיטה שלנו, אנו יכולים להראות כי תאי גזע mesenchymal עמידים יחסית נגד קרינה מייננת עיכוב topoisomerase אבל רגיש גליומיאצין. כמו אדי PFA רעילים, תמיד להשתמש מכסה המנוע אדים בעת הכנת פתרון הקיבעון במהלך שלב הקיבעון.
זכור גם ללבוש כפפות בעת טיפול DAPI.
