Die Methode liefert Informationen über zellzyklusabhängige Behandlungseffekte und ermöglicht und vertieft das Zusammenspiel von Zellproliferation und Bewältigungsmechanismen gegen DNA-Schäden. Diese Methode kombiniert wichtige Endpunkte aus der DNA-Schadensreaktion, einschließlich Doppelstrang-Frag-Erkennung und -Reparatur, Zellzykluseffekte und schließlich Zelltod durch Apoptose in einem umfassenden Test. Wir haben diese Technik hauptsächlich verwendet, um spezifische Behandlungsreaktionen und Nebenwirkungen von radiochemotherapeutischen Behandlungen in der klinischen Onkologie zu untersuchen.
Der Assay ist sehr nützlich für korrelative Studien in den Bereichen Radiobiologie und Strahlentherapie, kann aber auch auf verschiedene andere Bereiche der Onkologie angewendet werden. Nachdem Sie die Zellen aus der Kultur nach Standard-Zellentnahmeverfahren gesammelt haben, setzen Sie das Pellet in einem Milliliter PBS wieder aus. Und übertragen Sie die Zellen in zwei Milliliter Fixierlösung in einer Haube.
Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur die Zellen durch Zentrifugieren sammeln und den Überstand dekantieren. Es ist wichtig, die Zellen als Einzelzellsuspension zu fixieren und die Fixierungszeit für alle Proben konstant zu halten. Geben Sie den anhaftenden Zellen genügend Zeit, um sich zu lösen, um schön abgerundete Zellen für die Analyse zu erhalten.
Lösen Sie dann das Pellet, indem Sie die Zellen in drei Millilitern 70% Ethanol anzapfen und wieder aussetzen. Um die Zellen vor der Färbung zu waschen, sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation, und lösen Sie das Pellet durch Klopfen. Dann die Zellen mit zwei aufeinanderfolgenden Wäschen mit drei Milliliter Waschlösung und einem Waschen mit einem Milliliter Waschlösung wieder aussetzen.
Entsorgen Sie den Überstand zwischen jeder Wäsche. Nach der letzten Wäsche den Überstand vorsichtig ansaugen, ohne das Pellet zu stören, und das Lucent-Pellet in 100 Mikroliter des interessierenden Antikörpercocktails wieder aufhängen. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur die Zellen durch Zentrifugieren sammeln und den Überstand vorsichtig ansaugen, ohne das Pellet zu stören.
Dann setzen Sie das gelockerte Pellet in 100 bis 250 Mikroliter DNA-Färbungslösung wieder auf und geben die Zellen durch die Zellsiebkappe eines Probenröhrchens mit einer Maschenöffnungsgröße von 35 Mikrometern aus. Um die Zellen durch Durchflusszytometrie zu analysieren, öffnen Sie die Registerkarte Parameter im Zytometerfenster, und wählen Sie die in der Tabelle angegebenen Parameter aus. Öffnen Sie als Nächstes das Arbeitsblattfenster, und erstellen Sie Diagramme wie angegeben.
Laden Sie eine Steuerprobe auf das Zytometer und drücken Sie die Run-Taste. Wählen Sie die erste Röhre im Browserfenster aus, und klicken Sie auf den Rohrnamen. Passen Sie die Detektorspannungen für Vorwärts- und Seitenstreuung und DAPI in der Parameter-Registerkarte des Inspektorfensters an.
Drücken Sie die Standby-Taste, um mit der Einrichtung des Arbeitsblatts in der Software fortzufahren. Verwenden Sie das Polygon-Gate-Werkzeug, um die Zellpopulation im Vorwärtsstreubereich im Vergleich zum Seitenstreubereichsdiagramm zu definieren, und verwenden Sie das Rechteck-Gate-Werkzeug, um die Grundgesamtheit einzelner Zellen in der DAPI mit einem DAPI-Flächendiagramm zu definieren. Drücken Sie die Taste G, um die Grundgesamtheitshierarchie anzuzeigen, und klicken Sie auf die Standard-Gate-Namen, um sie umzubenennen.
Anschließend klicken Sie mit der rechten Maustaste auf alle Histogramme, um Populationen und einzelne Zellen aus dem Kontextmenü anzuzeigen. Erfassen Sie Steuer- und behandelte Proben, um die Detektorspannungen für die antikörpergekoppelten Fluorophore zu optimieren, um den gesamten Dynamikbereich des Signals abzudecken. Um die Proben zu messen, drücken Sie die Run-Taste auf dem Zytometer und verwenden Sie das Erfassungs-Dashboard in der Software, um die Proben zu messen.
Wählen Sie dann Datei, Export und Experimente aus, um den Verzeichnisexport im Dialogfeld auszuwählen, um die Daten als Punkt-FCS-Dateien zu speichern. Um die Daten auszuwerten, ziehen Sie die Punkt-FCS-Dateien in den Beispielbrowser der flow cytometrischen Analysesoftware. Verwenden Sie das Polygonwerkzeug, um die Zellenpopulation im Diagramm vorwärts und seitlich eziellungsflächen zu definieren und Trümmer aus der Analyse auszuschließen.
Verwenden Sie in der DAPI mit im Vergleich zu DAPI-Flächendiagramm das Rechteckwerkzeug, um die Grundgesamtheit einzelner Zellen zu definieren und alle Zelldoublets oder Klumpen aus der Analyse auszuschließen. Verwenden Sie im DAPI-Bereich Histogramm das Bisektor-Tool, um einzelne Zellen mit einem normalen DNA-Gehalt von apoptotischen Zellen mit degradierter DNA zu unterscheiden. Wählen Sie Werkzeugbiologie und Zellzyklus aus, um das Werkzeug zur Zellzyklusmodellierung zu öffnen, und wählen Sie Dean-Jett Fox aus, um die Häufigkeit von Zellen in den Phasen G 1 S und G zwei M zu schätzen.
Erstellen Sie G 1 S- und G-Zwei- und M-Phasentore in der DAPI mit einem Im-DAPI-Flächendiagramm der Zellzykluspopulation, um eine zellzyklusspezifische Gamma H-Messung zwei A X zu ermöglichen. Verwenden Sie das Bisektor-Tool, um Phosphohiston H drei positive und negative Zellen im Alexa 555 Bereich Histogramm der Zellzykluspopulation zu unterscheiden und CAS-Basis drei positive und negative Zellen im Alexa 647 Bereich Histogramm der Einzelzellen Population zu unterscheiden. Drücken Sie die Taste T, um den Tabelleneditor zu öffnen und die Tabelle wie angegeben zu konfigurieren.
Wählen Sie dann In Datei aus, um das Format und das Ziel im Ausgabeabschnitt des Menübands festzulegen und die Daten in ein Spreadsheet zu exportieren. Kohlenstoffionen induzieren höhere Gamma H zwei AX-Spitzenwerte in Glioblastom-Zellen, die langsamer abnehmen und in 24 bis 48 Stunden deutlich erhöht bleiben, verglichen mit Photonenstrahlung bei der gleichen physikalischen Dosis. Sowohl bei Kohlenstoffionen als auch bei Photonenstrahlung waren die Gamma H-Werte zwei AX in G-Phasenzellen wahrscheinlich am höchsten, da die DNA-Doppelstrangbruchreparatur auf den Weg der nicht-homologen Endverbindung in diesem Stadium des Zellzyklus beschränkt ist.
Im Einklang mit der höheren Doppelstrangbruch-Induktionsrate und der langsameren Reparaturkinetik induzieren Kohlenstoffionen einen stärkeren und länger anhaltenden Zellzyklusstillstand in G zwei Phasen und eine höhere Apoptoserate als Photonen. Je nach Stärke des Behandlungseffekts kann die Auflösung der verschiedenen Zellzyklusphasen eine Herausforderung sein. In einigen Zelllinien hat die DAPI-Konzentration einen großen Einfluss auf die Qualität des Zellzyklusprofils und muss angepasst werden.
Folien können aus den verbleibenden Proben nach der Durchflusszytometrie hergestellt werden, um die Anzahl, Größe und Form von Gamma H zwei AX-Schwerpunkten zu bewerten und zwischen fokalen und parnuklearen Gamma H zwei AX-Färbungen zu unterscheiden. Mit unserer Methode konnten wir zeigen, dass mesenchymale Stammzellen relativ resistent gegen ionisierende Strahlungen und Topoisomerase-Hemmung sind, aber empfindlich gegen Gliomyacin. Da PFA-Dämpfe giftig sind, verwenden Sie immer eine Dunstabzugshaube bei der Vorbereitung der Fixierungslösung und während des Fixierungsschritts.
Denken Sie auch daran, Handschuhe zu tragen, wenn Sie mit DAPI umgehen.
