La méthode fournit des informations sur les effets du traitement dépendant du cycle cellulaire et permet et une étude approfondie de l’interaction entre la prolifération cellulaire et les mécanismes d’adaptation contre les dommages à l’ADN. Cette méthode combine des points de terminaison importants de la réponse de dommages d’ADN comprenant la reconnaissance et la réparation de frag de double brin, les effets de cycle cellulaire, et la mort éventuelle de cellules par apoptose dans un essai complet. Nous avons utilisé cette technique principalement pour étudier les réponses spécifiques au traitement et les effets secondaires des traitements radiochemotherapeutic en oncologie clinique.
L’essai est très utile pour les études corrélatives dans les domaines de la radiobiologie et de la radiothérapie, mais il peut également être appliqué à divers autres domaines de l’oncologie. Après avoir recueilli les cellules de la culture selon les procédures standard de collecte cellulaire, résuspendez la pastille en un millilitre de PBS. Et transférer les cellules en deux millilitres de solution de fixation dans une hotte.
Après une incubation de 10 minutes à température ambiante, recueillir les cellules par centrifugation et décanter le surnatant. Il est important de fixer les cellules comme une suspension à cellule unique, et de garder le temps de fixation constant pour tous les échantillons. Donnez aux cellules adhérentes suffisamment de temps pour se détacher pour obtenir des cellules bien arrondies pour l’analyse.
Puis desserrez la pastille en tapant et en réutilisant les cellules en trois millilitres de 70% d’éthanol. Pour laver les cellules avant de les soutrer, sédimenter les cellules par centrifugation et desserrer la pastille en tapant. Puis résuspendez les cellules avec deux lavages consécutifs avec trois millilitres de solution de lavage et un lavage avec un millilitre de solution de lavage.
Jeter le supernatant entre chaque lavage. Après le dernier lavage, aspirez soigneusement le supernatant sans déranger la pastille et resuspendez la pastille de lucent dans 100 microlitres du cocktail d’anticorps d’intérêt. Après une heure à température ambiante, recueillir les cellules par centrifugation et aspirer soigneusement le supernatant sans déranger la pastille.
Ensuite, resuspendez la pastille desserrée dans 100 à 250 microlitres de solution de coloration de l’ADN et distribuez les cellules à travers le bouchon de passoire cellulaire d’un tube d’échantillon avec une taille de pore en maille de 35 micromètres. Pour analyser les cellules par cytométrie d’écoulement, ouvrez l’onglet paramètres dans la fenêtre du cytomètre et sélectionnez les paramètres indiqués dans le tableau. Ensuite, ouvrez la fenêtre de la feuille de travail et créez des parcelles comme indiqué.
Chargez un échantillon de commande sur le cytomètre et appuyez sur le bouton d’exécuteur. Sélectionnez le premier tube dans la fenêtre du navigateur et cliquez sur le nom du tube. Ajustez les tensions du détecteur pour la dispersion avant et latérale et le DAPI dans l’onglet paramètres de la fenêtre de l’inspecteur.
Appuyez sur le bouton veille pour continuer avec la configuration de la feuille de travail dans le logiciel. Utilisez l’outil de barrière de polygone pour définir la population des cellules dans la zone de dispersion avant par rapport à la parcelle latérale de zone de dispersion et utilisez l’outil de porte de rectangle pour définir la population des cellules simples dans la parcelle de zone DAPI avec versus DAPI. Contrôle de presse G pour afficher la hiérarchie de la population et cliquez sur les noms de porte par défaut pour les renommer.
Par la suite, cliquez à droite sur tous les histogrammes pour sélectionner les populations et les cellules individuelles du menu contexte. Acquérir des échantillons de contrôle et traités afin d’optimiser les tensions du détecteur pour les fluorophores couplés aux anticorps afin de couvrir toute la plage dynamique du signal. Pour mesurer les échantillons, appuyez sur le bouton d’exécuteur sur le cytomètre et utilisez le tableau de bord d’acquisition dans le logiciel pour mesurer les échantillons.
Sélectionnez ensuite des fichiers, des exportations et des expériences pour sélectionner l’exportation d’annuaires dans la boîte de dialogue pour enregistrer les données sous forme de fichiers FCS à points. Pour évaluer les données, faites glisser et déposez les fichiers FCS point dans le navigateur d’échantillon du logiciel d’analyse cytométrique de flux. Et utilisez l’outil polygone pour définir la population des cellules dans la parcelle de zone de dispersion avant contre latérale et pour exclure les débris de l’analyse.
Dans la parcelle de zone DAPI avec versus DAPI, utilisez l’outil rectangle pour définir la population des cellules individuelles et exclure de l’analyse les doublets ou touffes cellulaires. Dans l’histogramme de secteur de DAPI, utilisez l’outil de bisector pour distinguer des cellules simples avec une teneur normale d’ADN des cellules apoptotiques avec l’ADN dégradé. Sélectionnez la biologie des outils et le cycle cellulaire pour ouvrir l’outil de modélisation du cycle cellulaire et sélectionnez Dean-Jett Fox pour estimer la fréquence des cellules dans les phases G un S et G deux M.
Créer G un S et G deux et M barrières de phase dans le DAPI avec versus DAPI parcelle de zone de la population cycle cellulaire pour permettre un cycle cellulaire spécifique gamma H deux A X mesure. Utilisez l’outil bisector pour distinguer la phosphohistone H de trois cellules positives et négatives dans l’histogramme de la région Alexa 555 de la population du cycle cellulaire et pour distinguer la base cas trois cellules positives et négatives dans l’histogramme de la région Alexa 647 de la population de cellules individuelles. Contrôle de presse T pour ouvrir l’éditeur de table et configurer la table comme indiqué.
Sélectionnez ensuite Fichier pour définir le format et la destination dans la section sortie du ruban de menu et exporter les données dans une feuille de diffusion. Les ions de carbone induisent des niveaux de pointe gamma H deux AX plus élevés dans les cellules du glioblastome qui diminuent plus lentement et restent significativement élevés en 24 à 48 heures par rapport au rayonnement photon à la même dose physique. Pour les ions de carbone et le rayonnement photon, les niveaux gamma H deux AX étaient les plus élevés dans les cellules de phase G un probablement parce que la réparation de rupture de double brin d’ADN est limitée à la voie de l’extrémité non homologous joignant à ce stade dans le cycle cellulaire.
Conformément au taux d’induction de rupture à double brin plus élevé et à la cinétique de réparation plus lente, les ions de carbone induisent une arrestation plus forte et plus durable du cycle cellulaire en phase G deux et un taux plus élevé d’apoptose que les photons. Selon la force de l’effet de traitement, la résolution des différentes phases du cycle cellulaire peut être difficile. Dans certaines lignées cellulaires, la concentration de DAPI a un impact important sur la qualité du profil du cycle cellulaire et doit être ajustée.
Les diapositives peuvent être préparées à partir des échantillons restants après la cytométrie d’écoulement afin d’évaluer le nombre, la taille et la forme des foyers gamma H deux AX et de faire la distinction entre la coloration gamma H deux AX focale et parnucléaire. En utilisant notre méthode, nous pourrions montrer que les cellules souches mésenchymales sont relativement résistantes contre les rayonnements ionisants et l’inhibition de la topoisomerase, mais sensibles à la gliomyacine. Comme les vapeurs de PFA sont toxiques, toujours utiliser un capot de fumée lors de la préparation de la solution de fixation et pendant l’étape de fixation.
N’oubliez pas non plus de porter des gants lors de la manipulation dapi.
