Uno de los mecanismos propuestos por los cuales los anticuerpos anti-Tau terapéuticos reducen la patología en la enfermedad de Alzheimer es la absorción en el aclaramiento de la patológica agregada ex Tau por microglia. Aquí, presentamos el ensayo de base celular para evaluar la absorción de Tau por microglia. Este ensayo representa una herramienta de investigación útil para caracterizar mejor el mecanismo de acción de los anticuerpos anti-Tau.
El primer día del experimento, preparar las células BV-2 lavándolas primero con 1x PBS en el matraz en el que se han cultivado. Luego incubarlos con 05%trypsin EDTA a 37 grados Celsius y 5%C02 hasta que se desprendan del matraz. Re-suspenda las células en el medio de cultivo pipeteando hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces.
Contar las células y preparar una suspensión celular con una concentración final de 100.000 células por mililitro en un medio de cultivo que contenga 200 microgramos por mililitro. Añadir 250 microlitros de esta suspensión celular por pozo en una placa inferior plana de cultivo de tejido de 96 pozos. Incubar la placa a 37 grados centígrados con 5%C02, durante la noche.
Después de descongelar los agregados de pH dye-Tau previamente preparados sobre hielo, diluirlos en 65 microlitros por condición de medio libre de suero, para hacer una solución nanomolar de 500. Diluir los anticuerpos en 65 microlitros de medio libre de suero para lograr el doble de la concentración deseada. Mezclar los agregados y anticuerpos pH dye-Tau en una placa inferior en U de 96 pozos.
Selle esta placa de dilución e incubar durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente retire el medio de la placa de 96 pozos con células BV-2. Lavar las células en cada pozo con 100 microlitros de temperatura ambiente 1x PBS.
Retire el PBS de la placa de celda BV-2. Utilice una pipeta multicanal para transferir 125 microlitros de aminoácidos de la placa de dilución a cada pozo de una placa celular BV-2 de 96 pocillos, e incubar durante dos horas a 37 grados centígrados con 5%CO2. Después de la incubación eliminar los complejos amino de las células y lavar las células en cada pozo con 100 microlitros de temperatura ambiente 1x PBS.
Después de retirar el 1x PBS añadir 50 microlitros de 25%trypsin EDTA e incubar durante 20 minutos a 37 grados Celsius con 5%CO2. Después de eso, agregue 200 microlitros de medio de cultivo y vuelva a suspender el pozo pipeteando hacia arriba y hacia abajo para separar las células. Transfiera las células a una placa inferior en U de 96 pozos y centrifuga a 400 x g durante 5 minutos a 4 grados centígrados.
Coloque la placa sobre hielo y retire el medio. Añadir 150 microlitros de hielo frío 1x PBS y centrifugar de nuevo a 400 g durante 5 minutos a 4 grados Centígrados. Coloque la placa sobre hielo y lave de nuevo retirando 1 veces PBS previamente añadido y añadiendo 150 microlitros de PBS helado por pozo.
Centrifugar de nuevo en las mismas condiciones. Coloque la placa sobre hielo y lave las células quitando el PBS previamente añadido y añadiendo 150 microlitros tampón FACS por pozo. Centrifugar de nuevo a 400 g durante 5 minutos a 4 grados centígrados.
Coloque la placa sobre hielo y retire el búfer FACS previamente agregado y vuelva a suspender las celdas en 200 microlitros de búfer FACS por pozo. Inmediatamente proceda a analizar por FACS para adquirir 20.000 eventos en la puerta de la celda en vivo. Para el análisis FACS, utilice el área de dispersión hacia delante o el área de dispersión frontal frente a la gráfica de densidad SSCA para gatear en celdas vivas excluyendo eventos con niveles de dispersión hacia adelante más bajos, como escombros y celdas muertas.
A continuación, dentro de la población de células vivas, utilice FSCA frente a la altura de dispersión hacia delante o FSCH para crear una sola puerta y excluir dobletes y agregados de celda. A continuación, utilice los eventos en la puerta singlet para generar un histograma de parámetro único de tinte de pH. Utilice el histograma generado para determinar primero la intensidad media de fluorescencia.
Después de eso determinar el porcentaje de células positivas de pH dye-Tau excluyendo las células negativas según lo determinado UTILIZANDO el único control de BV-2. Los anticuerpos CBTau-28.1 promueven una absorción de Tau en células BV-2 de una manera dependiente de la dosis, como lo muestra la citometría de flujo. El anticuerpo doble mutante de alta afinidad CBTau-28.1 mediaba la absorción de Tau en las células BV-2 en una medida mayor que el anticuerpo de tipo salvaje.
Los fragmentos de CBTau-28.1 Fab no aumentaron la absorción basal de Tau indicando un mecanismo de internalización mediado por el receptor FC. La microscopía confocal confirmó el aumento mediado por anticuerpos de la absorción de Tau. Tinte de pH verde etiquetado Tau agregados a menudo co-localizados con tinte rojo lisotracker teñidos orgía de orgánulos ácidos, lo que sugiere la presencia de agregados Tau en un compartimiento endolysosomal.
Los fragmentos de CBTau-28.1 Fab no aumentaron la absorción de Tau de nuevo indicando que la absorción fue de hecho FC mediada. El ensayo que acabamos de describir nos permite cuantificar específicamente consistentemente la absorción de Tau mediada por anticuerpos por microglia. Los datos generados con este ensayo pueden ayudar a esclarecer el mecanismo de acción de los anticuerpos anti-Tau, representando así una herramienta útil para avanzar en los anticuerpos anti-Tau para seguir avanzando en su desarrollo como posible tratamiento anti AD.
