This work was supported by the National Institute on Aging (AG039768) to MHK. We thank Drs. Thomas Sharkey and Honggao Yan for generously providing the instruments, as well Sean Weise and Yan Wu for technical assistance.

1. Preparación de los reactivos <ol><li> Preparar tampón de agregación (20 mM Tris, pH 7,4, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Guarde a temperatura ambiente, estable durante meses. Suplemento ditiotreitol 1 mM (DTT) antes de su uso. NOTA: un búfer basado en HEPES (10 mM HEPES, pH 7,5, EDTA 0,1 mM, DTT 5 mM) también produce resultados similares en la agregación de tau. </li><li> Preparar tioflavina T o tioflavina S solución madre (3 mM, disuelto en tampón agregación), y filtrar por 0,22 micras unidad de filtro estéril. Almacenar a -20 ° C en un tubo cubierto con papel de aluminio, estables durante meses. </li><li> Prepare la solución de heparina de valores (300 mM, disueltos en tampón de agregación). Almacenar a -20 ° C, estable durante meses. </li><li> Preparar ditiotreitol (DTT) stock (1 M, se disuelve en agua). Alícuota en tubos de 1,5 ml. Almacenar a -20 ° C. Antes de ensayos de agregación, descongelar la solución 1 M a temperatura ambiente. A partir de este 1,000x madre, preparar una alícuota de 100 mM de solución madre de trabajo con agua destilada. Deja en el hielohasta que esté listo. </li><li> Eliminar tau de -80 ° C congelador. Descongele en hielo. Ajuste tau a la concentración predeterminada con el tampón de agregación. Centrifugado en una microcentrífuga a 20.800 xg durante 10 min a 4 ° C para eliminar grandes agregados pre-formadas. Esta etapa de pre-hilado aumenta la coherencia en la medición de fluorescencia posterior de cada lote de la preparación de proteína. Transferir el sobrenadante a otro tubo; dejar en hielo hasta que esté listo para montar la reacción de agregación. </li></ol> 2. No-dye, Ensayo Terminal NOTA: La reacción de agregación de este ensayo se realiza en ausencia del colorante fluorescente. Después de mezclar todos los componentes, la reacción se deja proceder a puntos de tiempo predeterminados. Las alícuotas son llevados a cabo de la reacción de agregación y mezclado con ThT o de ThS para la unión antes de la lectura de fluorescencia amiloide. El volumen inicial de la reacción de agregación depende del número de puntos de tiempo necesarios. Este enfoque puede REQUire una gran cantidad de la proteína tau, pero es rápido, sencillo, y se puede hacer en un fluorómetro o un lector de placas de múltiples pocillos (ver Discusión). A continuación se muestra la operación paso a paso, usando el ISA SPEX FluoroMax-2 espectrofluorómetro compacto para la cuantificación de la fluorescencia. <ol><li> Establecer la mezcla de agregación en 1,5 ml tubos Eppendorf como en la Tabla 1. Cada columna representa los ingredientes necesarios para una reacción de 100 l, que es suficiente para una medición de punto de tiempo. Ajuste la cantidad para toda la mezcla de agregación basado en los puntos de tiempo necesarios para el experimento en particular. Añadir 10% adicional de cada componente para dar margen para el error pipetear. La heparina de reacción que contiene típica se muestra aquí puede ser reemplazado por ácido araquidónico o tampón agregación. Añadir DTT a 1 mM a la mezcla de reacción. Si toda la reacción dura más de un día, complementar fresco TDT cotidiana (1 mM) para asegurar un ambiente reductor. </li><li> Invierta el tubo varias veces para mezclar. Place cada reacción en una incubadora o baño de agua 37 ° C. La agitación no es necesario para la agregación de tau. </li><li> Antes de medir la fluorescencia, encienda el espectrofluorómetro (lámpara primero, y luego la computadora). NOTA: La lámpara de arco de xenón que se puede utilizar de inmediato. Sin embargo, para obtener mejores resultados permiten que la máquina se caliente durante unos 10 minutos antes de la lectura de fluorescencia. </li><li> Inicie el software en el ordenador. <ol><li> Seleccione el modo de visualización en tiempo real en el Centro de Control de Instrumentos, ajuste la longitud de onda de excitación de 450 nm (hendidura a 2 nm) y la longitud de onda de emisión a 510 nm (hendidura a 5 nm). Cerrar la ventana Modo de visualización en tiempo real para volver al Centro de Control de Instrumentos. </li><li> Elija clave Constant Análisis de longitud de onda, pulse Agregar &gt;&gt; en el marco superior para agregar longitudes de onda conjuntos. Establecer los parámetros de adquisición de error estándar a 1 y Ensayos máximo a 3, a continuación, haga clic en Agregar. Haga clic en Ir para abrir la pantalla de datosventana. </li><li> En la ventana de visualización de datos, haga clic en Inicio Acq para abrir el cuadro de diálogo Muestra Nuevo. Elija &quot;desconocido&quot; para el tipo de muestra. </li></ol></li><li> Para cada mezcla de agregación 100 l, añadir 98 l de tampón agregación y 2 l 3 mM tioflavina T. Pipet varias veces para mezclar. </li><li> Transferir la totalidad de la mezcla a una cubeta (FCA3, la dimensión exterior, WxLxH = 12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm). Colocar la cubeta en el soporte de muestra en la muestra-compartimento y cerrar la tapa. Haga clic en Ejecutar para recoger los datos de fluorescencia. Grabe los datos. </li><li> Retire la cubeta y decantar la solución. Enjuague la cubeta de agua destilada 3 veces. Seco soplando aire dentro y fuera de la cubeta. </li></ol> 3. Con-dye, continua Ensayo modo en un lector de placas SpectraMax M2 NOTA: Este ensayo difiere de la anterior en que el colorante fluorescente ThT o de ThS está incluido en el, la agregaciónreacción ción. Esto permite la medición continua de la misma serie de reacciones. Debido al uso repetitivo de la reacción, este método se realiza mejor con un lector de placas de múltiples pocillos automático (como se muestra a continuación el funcionamiento de SpectraMax M2). Un fluorómetro regular también funciona, pero la frecuencia de la medición de las reacciones de agregación rápidos es algo limitada, debido a la naturaleza manual de la operación. <ol><li> Establecer la mezcla de agregación en una placa de 96 pocillos (placa de 96 pocillos de color negro sólido, bien volumen 360 l, de fondo plano) como en la Tabla 2. Cada columna representa los ingredientes necesarios para una reacción de 200 l, que es suficiente para una la medición del tiempo de punto. Mezclar bien pipeteando varias veces. Suplemento fresco DTT 1 mM cada día durante todo el curso de los experimentos. </li><li> Incubar la placa de 96 pocillos a 37 ° C. </li><li> En cada punto de tiempo antes de la medición de la fluorescencia, encienda el lector de microplacas multimodo y el ordenador. Deje tiempo suficiente para que el mamáquina para estabilizar, a unos 10 min. </li><li> Inicie el software en el ordenador. Ajuste la temperatura a 37 ° C y elegir la intensidad de fluorescencia de modo (FI-Top Leer), ajuste la longitud de onda de excitación a 450 nm y emisión a 510 nm de longitud de onda. </li><li> Inserte la placa de 96 pocillos en el cajón y pulse la tecla READ para iniciar la medición. </li><li> Después de leer, eliminar la placa y volver de nuevo a los 37 ° C incubadora. Copie los datos y pegar en una hoja de cálculo Excel para análisis de datos y el trazado. </li></ol> 4. Con-dye, continua el modo de ensayo en una Spectrofluorometer compacto <ol><li> Establecer la mezcla de agregación en 1,5 ml tubos Eppendorf como en la Tabla 3. Cada columna representa los ingredientes necesarios para una reacción de 200 l, que es suficiente para una medición de punto de tiempo. </li><li> Invierta el tubo varias veces para mezclar. </li><li> Encienda el espectrofluorómetro y configurar el software como en los pasos 2.3 y 2.4. </li><li> Transfiera la mezcla entera tcubeta OA. Colocar la cubeta en el soporte de muestra en la muestra-compartimento y cerrar la tapa. Haga clic en Ejecutar para recoger los datos de fluorescencia. Grabe los datos. </li><li> Continuar leyendo a intervalos apropiados haciendo clic en Ejecutar y registrar los datos. Si la agregación es ser controlados en una alta frecuencia (por ejemplo, cada 30 o 60 seg), dejar la reacción en la cubeta y en la máquina hasta que la medición ha terminado, o cuando hay tiempo suficiente para intercambiar reacciones o cubetas. </li><li> Retire la cubeta y decantar la solución. Enjuague la cubeta de agua destilada 3 veces. Seco soplando aire dentro y fuera de la cubeta. </li></ol>

We have nothing to disclose.

Este protocolo demuestra diferentes condiciones de ensayo y los instrumentos que detectan las tau rápida cinética de agregación dependientes de la fosforilación. En el ensayo de terminal, se añade el colorante de fluorescencia ThT a una porción de la reacción retirado de la mezcla maestra en cada punto de tiempo. Amiloide inducida por la unión de fluorescencia se mide entonces 26. En el segundo, con tinte modo, la agregación de tau se lleva a cabo en presencia de ThT o de ThS, lo que hace este tipo d...

La enfermedad de Alzheimer (AD) es una de una gran colección de los trastornos neurodegenerativos conocidos como tauopatías. El tauopatía patología subyacente por excelencia es los ovillos neurofibrilares, NFT, en las neuronas, astrocitos y microglia 1-4. La densidad NFT correlaciona con deterioro cognitivo 3,5 y pérdida de neuronas 6. NFT contiene proteína tau hiperfosforilada principalmente (referido como &quot;p-tau&quot; de ahora en adelante) que forma filamentos helicoidales apareados o rectas (PHF) 7,8. Tau es una proteína asociada a microtúbulos pensado para facilitar el transporte axonal que es esencial para la señalización neuronal y el tráfico de 9,10. Cada molécula de tau contiene de 2 a 3 fosfatos en el cerebro normal, pero el contenido de fosforilo aumenta en varios pliegues en pacientes tauopatía 11. Múltiples quinasas pueden contribuir a la hiperfosforilación de tau incluyendo GSK3 (glucógeno sintasa quinasa 3β) y CDK5 (ciclina-dequinasa pendiente 5) 12,13, pero el gatillo directo para la fosforilación patológica sigue siendo difícil de alcanzar 14. Fosforilación anormal en o cerca de los motivos de unión a microtúbulos tau se disocia de los microtúbulos 15, y causa tau mala localización al compartimiento somatodendrítico, donde p-tau oligomeriza en filamentos helicoidales rectos o pareadas que eventualmente pueden polimerizarse en inclusiones NFT. La estrecha relación entre la hiperfosforilación de tau, la formación de NFT, y la neurodegeneración condujo a una hipótesis prevalente que ovillos p-tau provocan respuestas citotóxicas apoptóticas y otros, y por lo tanto es la causa subyacente de tauopatía neurodegeneración 16,17. Las pruebas toxicológicas y ensayos clínicos preliminares en base a esta premisa se ​​han puesto en marcha 18. Sin embargo, esta hipótesis se enfrenta a retos 19,20. Por ejemplo, SantaCruz et al. Mostró que las funciones cognitivas de los ratones transgénicos se pueden mejorar mediante la supresión de la expresión de un mutantetau humana, aunque NFTs continuaron para formar a partir de moléculas de tau existentes 21. En un modelo de Drosophila, NFT se demostró para secuestrar la tau citosólica tóxico para proteger las células neuronales subyacentes 22,23. Claramente, el papel patogénesis de NFT, en su caso, será de gran impacto la dirección del desarrollo de la terapéutica tauopatía. En concentraciones altas, la proteína tau recombinante cerebro o normal espontáneamente pero poco a poco se polimeriza en una estructura de PHF como in vitro, como se indica por la unión de varios colorantes β-hoja preferidos fluorescentes, microscopía electrónica, y la espectroscopia de dispersión de luz 24-27. La adición de heparina o ácido araquidónico, un ácido graso abundante en el cerebro humano, se acelera drásticamente la formación de PHF tau en isoform- e inductor dependientes de la concentración modales 28-32. Curiosamente, tau hiperfosforilada purificó a partir de cerebros con EA o preparado por exhaustiva en las reacciones de fosforilación in vitro unaggregates más rápido y más eficientemente 26,33-35. Estos resultados están en excelente acuerdo con las funciones patológicas de p-tau. Un sistema in vitro basado en la agregación de p-tau puede así servir como una poderosa herramienta para la detección de drogas AD. Dada la estrecha asociación entre la agregación de tau y la neurodegeneración progresiva de AD, así como el reciente fracaso en el desarrollo de fármacos dirigidos la placa Aß, otro marcador histológico clave de AD 36-38, el interés en el descubrimiento de fármacos que controlan la agregación de tau está en aumento. De hecho, varios grupos han comenzado ya las pantallas de drogas en diferentes rendimiento, utilizando en las reacciones de agregación de tau in vitro como el ensayo principal. Se encontró un número de productos químicos que presentan actividades inhibidoras o de reversión sobre la agregación de tau in vitro 39-42. Sin embargo, todas las pantallas actuales reguladores de agregación de tau tau usan sin modificar que pierde la marca patológica clave de fósforoilación, elevando la preocupación por la especificidad y la eficacia del uso de estos compuestos en el tratamiento de la EA. Uno de los principales obstáculos para desarrollar ensayos de agregación para la caracterización bioquímica y la detección de drogas AD es la producción de cantidades suficientes de la proteína tau hiperfosforilada patofisiológicamente relevante. Utilizando el sistema de Catálisis Cremalleras asistida en la que la isoforma 1N4R de tau y la quinasa GSK-3β se coexpresarse en E. coli como proteínas de fusión de cremallera de leucina, hemos superado este desafío (. Sui et al, presentado; véase la Figura 1 para los productos finales de tau y P-tau; ver también 43 para la caracterización preliminar de espectrometría de masas de p-tau). Desde un panel de nueve anticuerpos específicos para diferentes sitios de fosforilación de tau, las señales positivas se observaron en ocho posiciones (datos no mostrados). A continuación, se describen los protocolos y las instrumentaciones que pueden diferenciar la agregación d cinéticaiferencias entre tau no modificado y especies de p-tau. Estos ensayos se modificaron a partir de los protocolos publicados que midieron el aumento de la fluorescencia de tioflavina T (ThT) o tioflavina S (THS) sobre amiloide (agregados de tau) de unión 26. En el primero &quot;terminal&quot;, enfoque sin tinte, reacciones de agregación se ensamblan y se incubaron en ausencia del colorante amiloide. En diferentes puntos de tiempo, se retira una alícuota de cada reacción y se mezcló con un volumen igual del tampón THT-que contiene para detener y permitir la agregación de ThT de obligar a los agregados de tau. La fluorescencia se midió mediante un FluoroMax-2 fluorómetro IAP. En la segunda &quot;con tinte&quot; ensayo de monitoreo continuo, ThT o de ThS está incluido en las reacciones de agregación. La fluorescencia se puede medir de forma continua durante todo el experimento de forma manual o usando un lector de placas múltiples. Además, se describe un ensayo que utiliza una concentración casi fisiológica de tau-tau y p para la agregación en el mo medición continuade. El efecto de la fosforilación sigue siendo fácilmente detectable. A continuación, vamos a describir los procedimientos de operación paso a paso, y mostrar resultados representativos de estos ensayos. La discusión de algunos de los pros y los contras de cada enfoque, así como las aplicaciones de detección de drogas potenciales seguirán. En una alta concentración, tau agregados en las estructuras de tipo amiloide espontáneamente. Sin embargo, en el laboratorio, fibrillization tau es típicamente acelerado por inductores tales como la heparina (peso molecular medio, 6.000 g / mol) y ácido araquidónico. Ejemplos mostrados en el presente documento incluyen 30 mM de heparina. La formación de agregados amiloides tau se controla por la fluorescencia resultante de la unión por tioflavina T (ThT) o tioflavina S (THS) amiloide. Tras la unión de los agregados de tau, ThT presenta un desplazamiento hacia el rojo de la fluorescencia (excitación: 450 nm; pico de emisión: 485 nm). Ths, por otro lado, tiene débil emisión a 510 nm (excitación a 450 nm) antes de la unión de amiloide, pero esta fluorescencE aumenta significativamente en presencia de una proteína amiloide tales como la tau agregada 44. Ambos colorantes funcionan bien en la detección de tau y P-tau agregación. Debido a la fuerte pico y relativamente amplia emisión de ThT (véase la Figura 2), sólo hay 30% de reducción en la unidad de fluorescencia a 510 nm. Por conveniencia, se utiliza la misma combinación de longitudes de onda de excitación / emisión (es decir, 450 nm / 510 nm) para controlar la agregación de tau cuando se utiliza colorante. La agregación de tau se puede realizar en presencia o ausencia del colorante, dependiendo del propósito del ensayo y la disponibilidad de la proteína tau. Ambos modos de reacciones se muestran a continuación. Además, se demuestra el funcionamiento de dos instrumentos diferentes - un fluorómetro de una sola muestra (ISA-SPEX FluoroMax-2) y un multi-lector de placa (SpectraMax M2). Los lectores deben ser capaces de adaptar estos protocolos para satisfacer sus necesidades específicas y la disponibilidad de instrumentos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="449">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:116px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:103px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Trizma&#160;base</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T1503</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:116px;">NaCl</td>
			<td style="width:128px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:103px;">MAL-7581-06</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:116px;">Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">15576-028</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Thioflavin T</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T3516</td>
			<td style="width:103px;">Stored in dark</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Thioflavin S</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T1892</td>
			<td style="width:103px;">Stored in dark</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:116px;">heparin</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">H3393</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:116px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">D9779</td>
			<td style="width:103px;">Stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">96-well plate</td>
			<td style="width:128px;">Corning</td>
			<td style="width:103px;">3917</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:116px;">ISA SPEX FluoroMax-2</td>
			<td style="width:128px;">Horiba</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:116px;">SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader</td>
			<td style="width:128px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:116px;">Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody</td>
			<td style="width:128px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:103px;">MAB3494</td>
			<td style="width:103px;">Stored at &#8211;80&#176;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

Uso de tau recombinante y p-tau (Figura 1), se establecieron dos protocolos diferentes para comparar la cinética de la agregación de tau y p-tau, aprovechando la fuerte emisión de fluorescencia de ThT y de ThS tras la unión a amiloide agregados de proteínas, incluyendo tau y p-tau (Figura 2). Con o sin el colorante fluorescente en la reacción de agregación, se observó mejora consistente de la agregación de tau por la hiperfosforilación (Figuras 3-5). Esta esti...

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In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Proteínas tau no modificados y hiperfosforiladas fueron utilizados en dos ensayos de agregación in vitro para revelar la cinética de agregación rápida hiperfosforilación-dependiente. Estos ensayos allanar el camino para futuras pantallas para los compuestos que pueden modular la propensión de tau hiperfosforilada para formar fibrillas que subyacen a la progresión de la enfermedad de Alzheimer.

En Vitro agregación ensayos usando hiperfosforilada proteína tau

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

18.2K vistas.  Michigan State University.  Proteínas tau no modificados y hiperfosforiladas fueron utilizados en dos ensayos de agregación in vitro para revelar la cinética de agregación rápida hiperfosforilación-dependiente. Estos ensayos allanar el camino para futuras pantallas para los compuestos que pueden modular la propensión de tau hiperfosforilada para formar fibrillas que subyacen a la progresión de la enfermedad de Alzheimer. 

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Investigación

Biología

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

Adhesión y agregación plaquetaria bajo flujo con células de microfluidos de flujo

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 de peso molecular basado en Fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Detección rápida homogénea de Ensayos Biológicos Usando el Sistema de modulación magnética biosensores

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

El análisis de Schwann-astrocito interacciones utilizando In Vitro Ensayos

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D de imágenes de la agregación de proteínas en células vivas

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Los ensayos acoplados para Monitoreo replegamiento de proteínas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

En la migración celular y la invasión ensayos in vitro

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In vitro metilación de ensayo para estudiar la proteína arginina metilación

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...