Nanopartículas de proteína auto-montada, ou SAPNs, podem ser usadas para desenvolver vacinas contra várias doenças infecciosas. Este método que descrevemos aqui pode ser usado para purificar, revatar e caracterizar SAPNs contendo um feixe de seis hélices. Esta nanopartícula pode apresentar antígenos triméricos em uma conformação nativa.
Com pequenas modificações, este método pode ser aplicado a outros construtos inovadores de vacinas SAPN. Além disso, pode ser facilmente transferível para produção em larga escala para ensaios clínicos. Para a lise de E.coli colhida expressando o feixe de seis hélices SAPN, use uma sonda com a saída de sônica de 150 watts com quatro segundos de sônica e seis segundos de descanso, para sonicar pelotas bacterianas resuspended em 40 mililitros de tampão sem imidazol no gelo por cinco minutos.
Centrifugar o lise celular para gerar um supernanato esclarecido e transferir o supernante para um frasco estéril de 150 mililitros. Em seguida, leve a amostra até um volume final de 100 mililitros com tampão fresco sem imidazol. Para isolar a proteína de interesse, abra o software FPLC e clique na opção Novo Método.
No menu Configurações de método, abra o menu suspenso da posição da coluna e selecione C1 Port 3. No menu suspenso mostrado pela técnica, selecione Afinidade. No menu suspenso do tipo coluna, selecione Outros, HisTrap HP e cinco mililitros.
O volume da coluna e as caixas de pressão serão automaticamente definidos para os valores apropriados. Clique em Delinear método e arraste os botões de aplicativo de equilíbrio e amostra, três botões de lavagem de coluna e o botão Elution do menu pop-up da Biblioteca de Fases ao lado da seta antes de fechar o menu da Biblioteca de Fases. Clique em Equilibração e defina os valores listados na tabela para Buffer Inicial B, Buffer Final B de 4%, 4% e Volume de Coluna, cinco.
Clique no Aplicativo Amostrar. Na caixa de carregamento de amostras, clique no botão de rádio para injetar amostra na coluna com bomba de amostra e confirme que a caixa ao lado da Taxa de Fluxo de Uso das Configurações do Método é verificada na caixa de injeção de amostra com a caixa de bomba do sistema. Altere o valor da caixa de volume para 100 mililitros e o Esquema de Coleta de Frações para Habilitar.
Despreste o tamanho da fração de uso da caixa Configurações do método e altere o Tamanho da Fração para quatro mililitros. Clique no primeiro botão 'Lavagem da coluna', defina os valores listados na tabela para Buffer Inicial B, Buffer B 4%, 4% e Volume de Coluna, 10. Clique na caixa De habilitar o esquema de coleta de frações e desciclar o tamanho da fração de uso das configurações do método.
Altere o tamanho da fração para quatro mililitros e clique no segundo botão Lavagem da coluna. Defina os valores na tabela para Buffer Inicial B, Buffer Final B, 0% e Volume de Coluna, cinco. Clique na caixa De habilitar o esquema de coleta de frações e desciclar o tamanho da fração de uso das configurações do método.
Altere o tamanho da fração para quatro mililitros e clique no terceiro botão Lavagem da coluna. Defina os valores na tabela para Buffer Inicial B, Buffer Final B, 0% e Volume da Coluna, 10. Clique no botão Capacitar o esquema de coleta de frações e desciclar o tamanho da fração de uso da caixa Configurações do método.
Em seguida, mude o Tamanho da Fração para quatro mililitros. Clique no botão Elution e clique com o botão direito do mouse nas informações na tabela. No menu pop-up, clique em Excluir passo e arraste o botão gradiente isocratic para a mesa duas vezes, de modo que haja duas entradas.
Defina o valor para a primeira entrada no Buffer Inicial B, Buffer Final B de 30%, 30% e Volume da Coluna, 10. Defina o valor para a segunda entrada para buffer inicial B, Buffer 100% Final B, 100% e Volume de Coluna, 10. Clique no botão Capacitar o esquema de coleta de frações e clique na caixa De tamanho de fração de uso da caixa Configurações do método.
Em seguida, clique em Salvar Como e nomeie a purificação do arquivo. Coloque a bomba Uma tubulação do FPLC no tampão de lavagem sem imidazol e a tubulação B da bomba no tampão imidazol de 500 mililitros. Coloque a tubulação da bomba de amostra na amostra de 100 mililitros e execute o programa de purificação.
Quando a lavagem isopropanol de 60%, pausar o programa, mover a bomba Uma tubulação da lavagem sem imidazol para a lavagem isopropanol de 60% e reiniciar o programa. No final da lavagem, pausa o programa novamente, devolva a bomba A tubo para o tampão de lavagem sem imidazol e reinicie o programa de purificação. Para avaliar a pureza da proteína purificada, primeiro combine as frações do fluxo através, lave uma, lave duas e lave três passos, em tubos cônicos individuais de 50 mililitros.
Em seguida, misture 15 microlitadores de cada tubo de amostra com 15 microliters de tampão 2X Laemmli em tubos individuais de microcentrífato de 0,5 mililitros e desnaturar as amostras a 95 graus Celsius por 10 minutos. No final da incubação, configure um aparelho de corrida de gel com três géis de poliacrilamida pré-moldados sem manchas em buffer de execução Tris-Glycine SDS-PAGE. Carregue oito microliters de marcador de peso molecular para o primeiro poço de cada gel e 30 microliters de amostra desnaturada para os outros poços.
Passe os géis a 200 volts até que a frente de corante atinja a parte inferior do gel e enxágue brevemente os géis com água desionizada antes de imediatamente fotografar com um sistema de imagem livre de manchas. Em seguida, identifique as frações que contêm faixas proteicas com o tamanho correto e acumule essas frações. Para o feixe de seis hélices SAPN repato, adicione 10 a 20 mililitros de proteína agrupada a um de diálise de 10 kilodalton de corte de peso molecular.
Dique o em oito ureia molar, Tris 20 mililitros, 5%de glicerol e TCEP de cinco mililitros à temperatura ambiente durante a noite. Na manhã seguinte, diminua a concentração de ureia no tampão de diálise passo em dois molares a cada duas horas para lentamente dilisar a ureia da amostra. Quando a concentração de ureia atingir dois molares, mova o aparelho de diálise para quatro graus Celsius e dilante a amostra em ureia de 120 milialares, tris de 20 milimilitos e 5% de glicerol durante a noite para terminar o reabascamento.
Na manhã seguinte, remova a proteína redobrada do e filtre o feixe de seis hélices SAPN através de um filtro de seringa de fluoreto de polivinildene de 0,22 micrômetros. Para medir o tamanho médio da partícula do feixe sapn de seis hélices, adicione 45 microliters de pacote SAPN de seis hélices a um cuvette descartável e coloque o cuvette na máquina DLS. Em seguida, crie um novo arquivo de medição e execute um procedimento operacional padrão pré-escrito para proteína em ureia de 120 milimonas, Tris de 20 mililitros e tampão de 5% de glicerol a 25 graus Celsius.
Então, inicie a medição. O tamanho médio Z, o PDI e os resultados de distribuição serão calculados para cada execução. A máquina lerá a amostra cinco vezes.
Este pacote sapn de seis hélices totalmente montado é construído sobre sequências proteicas que são previstas para dobrar em uma partícula que contém 60 cópias do monômero. O total de lise celular foi usado para purificar os monômeros SAPN de seis hélices por FPLC usando uma coluna de níquel, demonstrando que a proteína eluicido em imidazol 150 e 500 milimolares. O cromatógrafo também mostra dois outros picos em 185 e 210 mililitros volume total correspondente à lavagem isopropanol e à lavagem sem imidazol, respectivamente.
As frações e a pureza da proteína recombinante poderiam ser identificadas por géis SDS-PAGE gradientes com a proteína de interesse localizada principalmente na fração 68 a 79. A análise de manchas ocidentais com anticorpos anti-His e anti-167D4 indicou que as frações agrupadas eram de fato a proteína de interesse. As manchas também demonstraram a presença do pacote de seis hélices SAPN multimers.
As amostras que continham os monômeros proteicos de interesse foram dobradas no pacote sapn de seis hélices totalmente montado por diálise e distribuição do tamanho das partículas foi determinada pela análise de rastreamento de DLS e nanopartículas. A visualização por microscopia eletrônica de transmissão revelou partículas SAPN de pacote individual de seis hélices bem formadas com a distribuição de tamanho obtida das duas técnicas de dimensionamento de partículas. O passo mais importante neste protocolo é a redobramento do pacote de seis hélices SAPN.
O pH correto e a força iônica do tampão de re dobramento são essenciais. Usando uma lavagem isopropanol durante a purificação, conseguimos reduzir a contaminação do LPS a um nível muito baixo. No entanto, o LPS pode ser reduzido ainda mais usando uma coluna de troca de ânion, conforme necessário.
Esta tecnologia pode ser facilmente adaptada para a aplicação humana. Um SAPN expresso em bactérias já foi ampliado para um próximo ensaio clínico de malária fase 1/2a.
