Kendi kendine biraraya gelen protein nano tanecikleri veya SAPN'ler, çeşitli bulaşıcı hastalıklara karşı aşıgeliştirmek için kullanılabilir. Burada tanımladığımız bu yöntem, altı sarli sayılslı bir paket içeren SAPN'leri arındırmak, yeniden katlamak ve karakterize etmek için kullanılabilir. Bu nanopartikül, trimerik antijenleri yerli benzeri bir konformasyonda sunabilir.
Hafif değişiklikler ile, bu yöntem diğer yenilikçi SAPN aşı yapıları uygulanabilir. Ayrıca, klinik çalışmalar için büyük ölçekli üretime kolayca aktarılabilir. Altı sarkaçlı demet SAPN ifade hasat E.coli lizis için, sonication dört saniye ve dinlenme altı saniye ile 150 watt sonication çıkış ile bir sonda kullanın, beş dakika boyunca buz üzerinde imidazol içermeyen tampon 40 mililitre resuspended bakteriyel pelet sonicate.
Santrifüj hücresel lysate netleştirilmiş bir supernatant oluşturmak ve steril bir 150 mililitrelik şişe süpernatant transfer. Daha sonra, taze imidazol içermeyen tampon ile 100 mililitre lik son bir hacme kadar numuneyi getirin. İlgi çekici proteini izole etmek için FPLC yazılımını açın ve Yeni Yöntem seçeneğini tıklayın.
Yöntem Ayarları menüsünde Sütun Konumu açılır menüsünü açın ve C1 Port 3'ünü seçin. Gösterilen Teknik açılır menüsünde Affinity'yi seçin. Sütun Türü açılır menüsünde Diğerleri, HisTrap HP ve beş mililitreyi seçin.
Sütun Hacmi ve Basınç kutuları otomatik olarak uygun değerlere ayarlanır. Faz Kitaplığı menüsünü kapatmadan önce Aşama Kitaplığı açılır menüsünden Yöntem Anahattı'nı tıklatın ve Equilibration ve Sample Application düğmelerini, üç Sütun Yıkama düğmesini ve Faz Kitaplığı açılır menüsünden Elution düğmesini sürükleyin. Equilibration'ı tıklatın ve tabloda listelenen değerleri Başlangıç Arabelleği B, %4 Nihai Arabellek B, %4 ve Sütun Hacmi, beş olarak ayarlayın.
Örnek Uygulama'yı tıklatın. Örnek Yükleme kutusunda, Örnek Pompalı Sütundaki Örnek Enjekte için radyo düğmesini tıklayın ve Yöntem Ayarlarından Kullanım Akış Hızı'nın yanındaki kutunun Sistem Pompası kutusuyla Örnek Enjeksiyon'da işaretlendiğini onaylayın. Birim kutusu değerini 100 mililitre ve Kesir Toplama Düzenini Etkinleştirme olarak değiştirin.
Yöntem Ayarları kutusundan Kesir Boyutunu Kullan'a tıklayın ve Kesir Boyutunu dört mililitreye değiştirin. İlk Sütun Yıkama düğmesine tıklayın, tabloda listelenen değerleri Başlangıç Arabellek B, %4 Nihai Arabellek B, %4 ve Sütun Hacmi, 10 olarak ayarlayın. Kesir Toplama Düzeni Etkinleştir kutusunu tıklatın ve Yöntem Ayarlarından Kesir Boyutunu Kullan'a tıklayın.
Kesir Boyutunu dört mililitreye değiştirin ve ikinci Sütun Yıka düğmesini tıklatın. Tablodaki değerleri Başlangıç Arabellek B, %0 Son Arabellek B, %0 ve Sütun Hacmi, beş olarak ayarlayın. Kesir Toplama Düzeni Etkinleştir kutusunu tıklatın ve Yöntem Ayarlarından Kesir Boyutunu Kullan'a tıklayın.
Kesir Boyutunu dört mililitreye değiştirin ve üçüncü Sütun Yıl düğmesini tıklatın. Tablodaki değerleri Başlangıç Arabellek B, %0 Son Arabellek B, %0 ve Sütun Hacmi, 10 olarak ayarlayın. Kesir Toplama Düzeni Etkinleştir düğmesini tıklatın ve Yöntem Ayarları kutusundan Kesir Boyutunu Kullan'a tıklayın.
Daha sonra, Kesir Boyutunu dört mililitreye değiştirin. Elution butonuna tıklayın ve tablodaki bilgileri sağ tıklatın. Açılan menüde, Adım Sil'i tıklatın ve iki giriş olması için Izokratik gradyan düğmesini iki kez tabloya sürükleyin.
İlk Arabellek B, %30 Son Arabellek B, %30 ve Sütun Hacmi, 10'a ilk girişin değerini ayarlayın. İlk Arabellek B,%100 Son Arabellek B, %100 ve Sütun Hacmi, 10'a ikinci girişin değerini ayarlayın. Kesir Toplama Düzeni Etkinleştir düğmesini tıklatın ve Yöntem Ayarları kutusundan Kesir Boyutunu Kullan'ı tıklatın.
Ardından, Farklı Kaydet'i tıklatın ve dosya temizlemeyi adlandırın. Pompa imidazol içermeyen yıkama tampon içine FPLC bir tüp yerleştirin, ve 500-milimolar imidazol tampon içine pompa B boru. Numune pompa borularını 100 mililitrelik numuneye yerleştirin ve arıtma programını çalıştırın.
% 60 izopropanol yıkama gerektiğinde, programı duraklatmak, % 60 izopropanol yıkama içine imidazol içermeyen yıkama pompa bir tüp hareket ve programı yeniden başlatın. Yıkama sonunda, programı tekrar duraklatın, pompa imidazol içermeyen yıkama tampon bir tüp dönmek ve arıtma programı yeniden başlatın. Saflaştırılmış proteinin saflığını değerlendirmek için, önce akıştan kesirleri birleştirin, birini yıkayın, iki tane yıkayın ve tek tek 50 mililitrelik konik tüplerde üç adımyı yıkayın.
Daha sonra, her numune tüpünden 15 mikrolitre ile 15 mikrolitre 2X Laemmli tamponu tek tek 0,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde karıştırın ve numuneleri 10 dakika boyunca 95 derecede denatüre edin. Kuluçka sonunda, Tris-Glycine SDS-PAGE çalışan tampon üç lekesiz dört ila% 20 prekast poliakrilamid jelleri ile bir jel çalışan cihaz kurmak. Her jelin ilk kuyusuna sekiz mikrolitre molekül ağırlık belirteci ve diğer kuyulara 30 mikrolitre denatüre numune yükleyin.
Boya ön jelin altına çarpana kadar 200 volt jelleri çalıştırın ve lekesiz görüntüleme sistemi ile hemen görüntüleme den önce jelleri deiyonize suyla kısa bir süre durulayın. Daha sonra, doğru boyutta protein bantları içeren kesirleri belirleyin ve bu kesirleri birleştirin. Altı sarkaçlı paket SAPN yeniden katlama için, 10 kilodalton moleküler ağırlık kesme diyaliz kaseti havuzlu protein 10 ila 20 mililitre ekleyin.
Diyaliz sekiz azı üre kaset, 20-milimolar Tris, 5%gliserol, ve oda sıcaklığında beş milimolar TCEP gece oda sıcaklığında. Ertesi sabah, diyaliz tamponunda üre konsantrasyonunu adım adım iki azı her iki saatte bir azaltarak üreyi yavaşça numuneden uzaklaştırın. Üre konsantrasyonu iki azı yağı ulaştığında, diyaliz cihazını dört santigrat dereceye taşıyın ve numuneyi 120 milimolar üre, 20 milimolar Tris ve %5 gliserol bir gecede yeniden katlamayı tamamlamak için diyalize alın.
Ertesi sabah, kasetten katlanmış proteini çıkarın ve altı sarlis demeti SAPN'i 0,22 mikrometrelik poliviniliden florür şırınga filtresinden filtreleyin. Altı sarlis demeti SAPN'in ortalama parçacık boyutunu ölçmek için, tek kullanımlık bir cuvette'ye 45 mikrolitre altı sarli sifonlu sapn ekleyin ve cuvette'yi DLS makinesine yerleştirin. Sonra, yeni bir ölçüm dosyası oluşturmak ve 120-milimolar üre protein için önceden yazılmış standart işletim prosedürü çalıştırmak, 20-milimolar Tris, ve 5% gliserol tampon 25 santigrat derece.
Sonra, ölçüm e başlayın. Z ortalaması boyutu, PDI ve dağıtım sonuçları her çalıştırma için hesaplanır. Makine örneği beş kez okuyacak.
Bu tamamen birleştirilmiş altı sarkaçlı demet SAPN, monomerin 60 kopyasını içeren bir parçacık halinde katlanması öngörülen protein dizileri üzerine kurulmuştur. Altı sarlis demeti SAPN monomerlerinin nikel kolon kullanılarak FPLC ile arındırMak için toplam hücre lisatı kullanıldı ve proteinin hem 150 hem de 500 milimolar imidazole eluted olduğunu gösterdi. Kromatogram da sırasıyla isopropanol yıkama ve imidazol içermeyen yıkama karşılık gelen 185 ve 210 mililitre toplam hacmi diğer iki zirveleri gösterir.
Rekombinant proteinin fraksiyonları ve saflığı, öncelikle 68'den 79'a kadar olan kısmıbulunan ilgi proteini ile degrade SDS-PAGE jelleri ile tanımlanabilir. Anti-His ve anti-167D4 antikorları ile Batı leke analizi havuzlu fraksiyonları gerçekten ilgi protein olduğunu gösterdi. Lekeler ayrıca altı sarlis demeti SAPN multimers varlığını gösterdi.
İlgiprotein monomerleri içeren numuneler diyaliz ile tam biraraya getirilmiş altı sarmallı demet SAPN içine katlandı ve parçacık boyutu dağılımı DLS ve nanopartikül izleme analizi ile belirlendi. İletim elektron mikroskobu ile görselleştirme, iki parçacık boyutlandırma tekniğinden elde edilen boyut dağılımı ile iyi biçimlendirilmiş bireysel altı sarmallı sapn parçacıkları ortaya çıkardı. Bu protokoldeki en önemli adım, altı sarlis demeti SAPN'in yeniden katlamasıdır.
Yeniden katlanır arabelleğin doğru pH ve iyonik mukavemeti esastır. Arınma sırasında izopropanol yıkama kullanarak, çok düşük bir seviyeye kirletici LPS azaltmak başardık. Ancak, LPS gerektiğinde bir aniyon değişim sütunu kullanılarak daha da azaltılabilir.
Bu teknoloji insan uygulaması için kolayca adapte edilebilir. Bakteriyel ifade edilmiş bir SAPN zaten yaklaşan bir faz 1/2a sıtma klinik deneme için ölçeklendirildi.
