자가 조립 단백질 나노 입자, 또는 SAPNs, 다양 한 전염병에 대 한 백신을 개발 하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서 설명하는 이 방법은 6개의 나선 번들을 포함하는 SAPNs를 정화, 재접기 및 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 나노 입자는 네이티브 와 같은 형태로 트리메릭 항원들을 제시 할 수 있습니다.
약간의 수정으로 이 방법은 다른 혁신적인 SAPN 백신 구조에 적용될 수 있습니다. 또한 임상 시험을 위해 대규모 생산으로 쉽게 이전할 수 있습니다. 6개의 나선 번들 SAPN을 표현하는 수확된 E.coli의 용액을 위해, 초음파 처리 4초와 6초의 휴식으로 150와트의 초음파 처리 출력을 가진 프로브를 사용하여 얼음에 이미다졸프리 버퍼 40밀리리터에 세균 펠릿을 초음파 처리합니다.
세포 용양을 원심분리하여 명확한 상체를 생성하고 상체를 멸균 150 밀리리터 플라스크로 이송합니다. 그런 다음, 신선한 imidazole 프리 버퍼와 100 밀리리터의 최종 볼륨까지 샘플을 가져. 관심 있는 단백질을 격리하려면 FPLC 소프트웨어를 열고 새 방법 옵션을 클릭합니다.
메서드 설정 메뉴에서 열 위치 드롭다운 메뉴를 열고 C1 포트 3을 선택합니다. 기술로 표시된 드롭다운 메뉴에서 선호도를 선택합니다. 열 유형 드롭다운 메뉴에서 다른 사용자, HisTrap HP 및 5밀리리터를 선택합니다.
열 볼륨 및 압력 상자는 자동으로 적절한 값으로 설정됩니다. 메서드 개요를 클릭하고 위상 라이브러리 메뉴를 닫기 전에 화살표 옆에 있는 위상 라이브러리 팝업 메뉴에서 평형 및 샘플 응용 프로그램 단추, 세 개의 열 세척 버튼 및 용출 버튼을 드래그합니다. 평형을 클릭하고 테이블에 나열된 값을 초기 버퍼 B, 4%최종 버퍼 B, 4%및 열 볼륨, 5로 설정합니다.
샘플 응용 프로그램을 클릭합니다. 샘플 로딩 상자에서 샘플 펌프가 있는 컬럼의 샘플 주입을 위한 라디오 버튼을 클릭하고 시스템 펌프 상자가 있는 샘플 주입에서 메서드 설정의 유량 사용 옆에 있는 상자가 체크인지 확인합니다. 볼륨 박스 값을 100 밀리리터로 변경하고 분수 수집 체계를 사용하도록 변경합니다.
메서드 설정 상자에서 분수 사용 크기를 클릭하고 분획 크기를 4밀리리터로 변경합니다. 첫 번째 열 세척 버튼을 클릭하고 테이블에 나열된 값을 초기 버퍼 B, 4%최종 버퍼 B, 4%및 열 볼륨 10으로 설정합니다. 분수 컬렉션 구성표 사용 상자를 클릭하고 메서드 설정에서 분수 사용 크기를 클릭합니다.
분획 크기를 4밀리리터로 변경하고 두 번째 열 세척 버튼을 클릭합니다. 테이블의 값을 초기 버퍼 B, 0%최종 버퍼 B, 0%및 열 볼륨, 5로 설정합니다. 분수 컬렉션 구성표 사용 상자를 클릭하고 메서드 설정에서 분수 사용 크기를 클릭합니다.
분획 크기를 4밀리리터로 변경하고 세 번째 열 세척 버튼을 클릭합니다. 테이블의 값을 초기 버퍼 B, 0%최종 버퍼 B, 0%및 열 볼륨, 10으로 설정합니다. 분획 컬렉션 구성표 사용 버튼을 클릭하고 메서드 설정 상자에서 분수 사용 크기를 클릭합니다.
그런 다음 분획 크기를 4 밀리리터로 변경합니다. 용출 버튼을 클릭하고 테이블의 정보를 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 팝업 메뉴에서 단계 삭제를 클릭하고 Isocratic 그라데이션 버튼을 두 번 테이블에 드래그하여 두 개의 항목이 있습니다.
초기 버퍼 B, 30%의 최종 버퍼 B, 30%및 열 볼륨, 10에 대한 첫 번째 항목에 대한 값을 설정합니다. 초기 버퍼 B, 100% 최종 버퍼 B, 100%및 열 볼륨, 10에 대한 두 번째 항목에 대한 값을 설정합니다. 분획 컬렉션 구성표 사용 버튼을 클릭하고 메서드 설정 상자에서 분수 크기 사용을 클릭합니다.
그런 다음 저장을 클릭하여 파일 정화의 이름을 지정합니다. 펌프 FPLC의 튜브를 이미다졸이 없는 세척 버퍼에 넣고 펌프 B 튜빙을 500밀리머 이미다졸 버퍼에 넣습니다. 샘플 펌프 튜빙을 100밀리리터 샘플에 넣고 정화 프로그램을 실행합니다.
60%의 이소프로판올 세척이 필요한 경우, 프로그램을 일시 중지하고, 펌프 A 튜브를 이미다졸 프리 워시에서 60%의 이소프로판올 세척으로 옮기고 프로그램을 다시 시작합니다. 세척이 끝나면 프로그램을 다시 일시 중지하고 펌프 A 튜브를 이미다졸 프리 워시 버퍼로 반환하고 정화 프로그램을 다시 시작합니다. 정제된 단백질의 순도를 평가하기 위해 먼저 흐름에서 분획을 결합하고, 세척하고, 2개를 씻고, 개별 50밀리리터 원뿔튜브에서 세 단계를 세척합니다.
다음으로 각 샘플 튜브의 마이크로리터 15개를 2X Laemmli 버퍼 15개에 개별 0.5밀리터 미세센심분리기 튜브에 혼합하고 샘플을 섭씨 95도에서 10분 동안 분해합니다. 인큐베이션의 끝에서, 트리스-글리신 SDS-PAGE 러닝 버퍼에 3개의 얼룩없는 4 ~20% 프리캐스트 폴리아크릴아미드 젤로 젤 러닝 장치를 설치하였다. 분자량 마커 8마이크로리터를 각 젤의 첫 번째 우물에 적재하고 30마이크로리터의 변성 시료를 다른 우물에 적재합니다.
염료 전면이 젤 바닥에 닿을 때까지 200 볼트에서 젤을 실행하고 염색되지 않은 이미징 시스템으로 즉시 이미징하기 전에 탈이온 된 물로 젤을 간략하게 헹구습니다. 그런 다음 올바른 크기와 단백질 밴드를 포함하는 분획을 식별하고 이러한 분획을 풀수 있습니다. 6개의 나선 번들 SAPN 리폴딩의 경우, 10킬로달톤 분자량 컷오프 투석 카세트에 풀링 단백질 10~20밀리리터를 추가합니다.
카세트를 8개의 어금니 우레아, 20밀리머 트리, 5%글리세롤, 5밀리머 TCEP로 밤새 실온에서 투석합니다. 다음 날 아침, 투석 버퍼의 우레아 농도를 2시간마다 2개의 어금니로 단계적으로 감소시켜 샘플에서 우레아를 천천히 투석한다. 우레아 농도가 2개의 어금니에 도달하면 투석 장치를 섭씨 4도로 이동하고 샘플을 120밀리몰라 우레아, 20밀리머 트리, 글리세롤 5%로 투석하여 하룻밤 사이에 다시 접는것을 완료합니다.
다음 아침, 카세트에서 다시 접힌 단백질을 제거하고 0.22 마이크로미터 폴리 비닐리덴 불소 주사기 필터를 통해 6-나선 번들 SAPN을 필터링합니다. 6개의 나선 번들 SAPN의 평균 입자 크기를 측정하려면 일회용 큐벳에 6개의 나선 번들 SAPN 45 마이크로리터를 추가하고 CUvette를 DLS 기계에 배치합니다. 다음으로, 새로운 측정 파일을 만들고 120 밀리머 우레아, 20 밀리머 트리, 5%글리세롤 완충액에서 단백질에 대한 사전 작성된 표준 작동 절차를 섭씨 25도에서 실행합니다.
그런 다음 측정을 시작합니다. Z 평균 크기, PDI 및 분포 결과는 각 실행에 대해 계산됩니다. 기계는 샘플을 다섯 번 읽습니다.
완전히 조립된 6개의 나선 번들 SAPN은 단량체 60부를 포함하는 입자로 접을 것으로 예상되는 단백질 서열에 내장되어 있습니다. 총 세포 용액은 니켈 컬럼을 사용하여 FPLC에 의해 6-헬릭스 번들 SAPN 단조체를 정화하는 데 사용되었으며, 단백질이 150 밀리머 와 500 밀리머 이미다졸 모두에서 용출되었다는 것을 입증했습니다. 크로마토그램은 또한 이소프로판올 세척과 이미다졸 프리 워시에 해당하는 총 부피 185 및 210 밀리리터의 두 개의 다른 피크를 보여줍니다.
재조합 단백질의 분획 및 순도는 주로 분수 68에서 79에 위치한 관심의 단백질을 가진 그라데이션 SDS-PAGE 젤에 의해 확인될 수 있었다. 항-His 및 항-167D4 항체를 가진 서양 얼룩 분석은 풀이 있는 분획이 실제로 관심있는 단백질이었다는 것을 표시했습니다. 또한 6개의 나선 번들 SAPN 멀티머의 존재를 보여주었습니다.
관심 있는 단백질 단량체를 함유한 시료는 투석 및 입자 크기 분포에 의해 완전히 조립된 6-나선 번들 SAPN으로 접혀 DLS 및 나노입자 추적 분석에 의해 결정되었다. 투과 전자 현미경 검사법에 의한 시각화는 두 입자 크기 조정 기술으로부터 얻은 크기 분포와 잘 형성된 개별 6-나선 번들 SAPN 입자를 밝혀냈다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 6개의 나선 번들 SAPN의 재접기입니다.
재폴딩 버퍼의 올바른 pH 및 이온 강도는 필수적입니다. 정제 시 이소프로판올 세척을 사용하여 오염 LPS를 매우 낮은 수준으로 줄일 수 있었습니다. 그러나 필요에 따라 음이온 교환 열을 사용하여 LPS를 추가로 줄일 수 있습니다.
이 기술은 인간의 응용 프로그램에 쉽게 적응할 수 있습니다. 세균성 표현된 SAPN은 이미 다가오는 1/2a 말라리아 임상 시험을 위해 확장되었습니다.
