Selbstzusammenstellung von Protein-Nanopartikeln oder SAPNs kann zur Entwicklung von Impfstoffen gegen verschiedene Infektionskrankheiten verwendet werden. Diese Methode, die wir hier beschreiben, kann verwendet werden, um SAPNs zu reinigen, neu zu falten und zu charakterisieren, die ein Sechs-Helix-Bundle enthalten. Dieses Nanopartikel kann trimerische Antigene in einer nativen konformen Konformation darstellen.
Mit leichten Modifikationen kann diese Methode auch auf andere innovative SAPN-Impfstoffkonstrukte angewendet werden. Darüber hinaus kann es leicht auf großflächige Produktion für klinische Studien übertragbar sein. Für die Lyse der geernteten E.coli, die das Sechs-Helix-Bundle SAPN exzessient, verwenden Sie eine Sonde mit der Beschallungsleistung von 150 Watt mit vier Sekunden Beschallung und sechs Sekunden Ruhezeit, um resuspendierte Bakterienpellets in 40 Milliliterimidazol-freiem Puffer auf Eis für fünf Minuten zu beschallen.
Zentrifugieren Sie das zelluläre Lysat, um einen geklärten Überstand zu erzeugen, und übertragen Sie den Überstand in einen sterilen 150-Milliliter-Kolben. Dann bringen Sie die Probe auf ein endgültiges Volumen von 100 Milliliter mit frischem Imidazol-freien Puffer. Um das Protein von Interesse zu isolieren, öffnen Sie die FPLC-Software und klicken Sie auf die Option Neue Methode.
Öffnen Sie im Menü Methodeneinstellungen das Dropdown-Menü Spaltenposition, und wählen Sie C1-Port 3 aus. Wählen Sie im Dropdownmenü Gezeigt nach Technik Affinität aus. Wählen Sie im Dropdownmenü Spaltentyp Andere, HisTrap HP und fünf Milliliter aus.
Das Spaltenvolumen und die Druckfelder werden automatisch auf die entsprechenden Werte gesetzt. Klicken Sie auf Methodenumriss, und ziehen Sie die Schaltflächen "Ausgleich" und "Beispielanwendung", drei Spaltenwäscheschaltflächen und die Schaltfläche Elution aus dem Popupmenü Phasenbibliothek neben dem Pfeil, bevor Sie das Menü Phasenbibliothek schließen. Klicken Sie auf Ausgleich, und legen Sie die in der Tabelle aufgeführten Werte auf Anfangspuffer B, 4%Endpuffer B, 4 % und Spaltenvolumen, fünf fest.
Klicken Sie auf Beispielanwendung. Klicken Sie im Feld Beispielbeladung auf das Optionsfeld für Das Einfügen von Sample auf Spalte mit Sample Pumpe, und bestätigen Sie, dass das Kontrollkästchen Flow-Rate aus Methodeneinstellungen verwenden im Feld Probeninjektion mit Systempumpe aktiviert ist. Ändern Sie den Volume-Boxwert auf 100 Milliliter und das Fraction Collection Scheme auf Aktivieren.
Deaktivieren Sie das Feld Bruchgröße aus Methodeneinstellungen verwenden, und ändern Sie die Bruchgröße auf vier Milliliter. Klicken Sie auf die erste Schaltfläche Spaltenwäsche, legen Sie die in der Tabelle aufgeführten Werte auf Anfangspuffer B, 4%Endpuffer B, 4% und Spaltenvolumen, 10 fest. Klicken Sie auf das Feld Fraction Collection Scheme Enable, und klicken Sie auf die Größe der Fraktion aus den Methodeneinstellungen verwenden.
Ändern Sie die Bruchgröße auf vier Milliliter, und klicken Sie auf die zweite Spalte waschen. Legen Sie die Werte in der Tabelle auf Anfangspuffer B, 0%Endpuffer B, 0% und Spaltenvolume, fünf fest. Klicken Sie auf das Feld Fraction Collection Scheme Enable, und klicken Sie auf die Größe der Fraktion aus den Methodeneinstellungen verwenden.
Ändern Sie die Bruchgröße auf vier Milliliter, und klicken Sie auf die dritte Spalte waschen. Legen Sie die Werte in der Tabelle auf Anfangspuffer B, 0%Endpuffer B, 0% und Spaltenvolume, 10 fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Bruchsammlungsschema aktivieren", und deaktivieren Sie das Feld Bruchgröße aus Methodeneinstellungen verwenden.
Ändern Sie dann die Bruchgröße auf vier Milliliter. Klicken Sie auf die Schaltfläche Elution und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Informationen in der Tabelle. Klicken Sie im Popup-Menü auf Schritt löschen, und ziehen Sie die Schaltfläche Isokratischer Farbverlauf zweimal auf die Tabelle, sodass es zwei Einträge gibt.
Legen Sie den Wert für den ersten Eintrag auf Anfangspuffer B, 30%Endpuffer B, 30 % und Spaltenvolume, 10 fest. Legen Sie den Wert für den zweiten Eintrag auf Initial Buffer B, 100%Final Buffer B, 100% und Column Volume, 10 fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Bruchsammlungsschema aktivieren", und klicken Sie auf das Feld Bruchbruchgröße aus Methodeneinstellungen verwenden.
Klicken Sie dann auf Speichern unter, und benennen Sie die Dateireinigung. Legen Sie die Pumpe A-Schläuche des FPLC in den Imidazol-freien Waschpuffer und die Pumpe B-Schläuche in den 500-Millimolar-Imidazolpuffer. Legen Sie den Probenpumpenschlauch in die 100-Milliliter-Probe und führen Sie das Reinigungsprogramm aus.
Wenn die 60%Isopropanol-Wäsche benötigt wird, halten Sie das Programm an, verschieben Sie die Pumpe A-Schläuche aus dem Imidazol-freien Waschen in die 60%Isopropanol-Wäsche, und starten Sie das Programm neu. Am Ende der Wäsche, halten Sie das Programm erneut, geben Sie die Pumpe A Schlauch in den imidazolfreien Waschpuffer, und starten Sie das Reinigungsprogramm. Um die Reinheit des gereinigten Proteins zu beurteilen, kombinieren Sie zunächst die Fraktionen aus dem Durchfluss, waschen Sie einen, waschen Sie zwei und waschen Sie drei Schritte, in einzelnen 50-Milliliter-Konikonröhren.
Als nächstes mischen Sie 15 Mikroliter aus jedem Probenröhrchen mit 15 Mikroliter 2X Laemmli Puffer in einzelnen 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohren und denaturieren die Proben bei 95 Grad Celsius für 10 Minuten. Am Ende der Inkubation wird ein Gellaufgerät mit drei fleckenfreien vier bis 20% vorgefertigten Polyacrylamidgelen im Tris-Glycin-SDS-PAGE-Laufpuffer aufgestellt. Laden Sie acht Mikroliter Molekulargewichtsmarker auf den ersten Brunnen jedes Gels und 30 Mikroliter denaturierter Probe in die anderen Brunnen.
Führen Sie die Gele mit 200 Volt, bis die Farbfront auf den Boden des Gels trifft und spülen Sie die Gele kurz mit entionisiertem Wasser ab, bevor Sie sofort mit einem fleckenfreien Bildgebungssystem bildgeben. Identifizieren Sie dann die Fraktionen, die Proteinbänder mit der richtigen Größe enthalten, und bündeln Sie diese Fraktionen. Für das Sechs-Helix-Bundle SAPN-Umfalten 10 bis 20 Milliliter gepooltes Protein zu einer 10 Kilodalton-Molekulargewichts-Cut-off-Dialysekassette hinzufügen.
Dialyze die Kassette in acht Molharnstoff, 20-Millimolar Tris, 5%Glycerin und fünf Millimolar TCEP bei Raumtemperatur über Nacht. Am nächsten Morgen die Harnstoffkonzentration im Dialysepuffer schrittweise um zwei Mol alle zwei Stunden zu verringern, um den Harnstoff langsam aus der Probe zu dialysieren. Wenn die Harnstoffkonzentration zwei Mol erreicht, bewegen Sie das Dialysegerät auf vier Grad Celsius und dialysieren Sie die Probe in 120-Millimolar-Harnstoff, 20-Millimolar Tris und 5% Glycerin über Nacht, um die Umfaltung zu beenden.
Am nächsten Morgen das umgeklappte Protein aus der Kassette entfernen und das Sechs-Helix-Bündel SAPN durch einen 0,22-Mikrometer-Polyvinyliden-Fluorid-Spritzenfilter filtern. Um die mittlere Partikelgröße des Sechs-Helix-Bündels SAPN zu messen, fügen Sie 45 Mikroliter Sechs-Helix-Bundle SAPN zu einer Einwegküvette hinzu und legen Sie die Küvette in die DLS-Maschine. Erstellen Sie als Nächstes eine neue Messdatei und führen Sie ein vorgefertigtes Standardbetriebsverfahren für Proteine in 120-Millimolar-Harnstoff, 20-Millimolar-Tris und 5% Glycerinpuffer bei 25 Grad Celsius aus.
Starten Sie dann die Messung. Die Größe des Z-Durchschnitts, die PDI und die Verteilungsergebnisse werden für jeden Durchlauf berechnet. Die Maschine liest das Beispiel fünfmal.
Dieses komplett montierte Sechs-Helix-Bundle SAPN basiert auf Proteinsequenzen, die sich voraussichtlich zu einem Teilchen falten, das 60 Kopien des Monomers enthält. Totales Zelllysat wurde verwendet, um das Sechs-Helix-Bundle SAPN-Monomere mittels FPLC mit einer Nickelsäule zu reinigen, was zeigt, dass das Protein sowohl bei 150- als auch bei 500-Millimolar-Imidazol eluierte. Das Chromatogramm zeigt auch zwei weitere Spitzen bei 185 bzw. 210 Milliliter Gesamtvolumen, die der Isopropanolwäsche bzw. der Imidazol-freien Wäsche entsprechen.
Die Fraktionen und die Reinheit des rekombinanten Proteins konnten durch Gradienten-SDS-PAGE-Gele identifiziert werden, wobei sich das Protein in erster Linie in Fraktion 68 bis 79 befindet. Western Blot Analyse mit Anti-His und Anti-167D4 Antikörper neratonen darauf, dass die gepoolten Fraktionen tatsächlich das Protein von Interesse waren. Die Flecken zeigten auch das Vorhandensein des Sechs-Helix-Bundles SAPN-Multimer.
Die Proben, die die von Interesse wichtigen Proteinmonomere enthielten, wurden durch Dialyse in das vollmontierte Sechs-Helix-Bundle SAPN gefaltet und die Partikelgrößenverteilung wurde durch DLS- und Nanopartikel-Tracking-Analyse bestimmt. Die Visualisierung durch Transmissionselektronenmikroskopie ergab wohlgeformte einzelne Sechs-Helix-Bundle-SAPN-Partikel mit der Größenverteilung, die aus den beiden Partikelgrößentechniken gewonnen wurde. Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die Neufaltung des Sechs-Helix-Bundles SAPN.
Der richtige pH-Wert und die Ionenstärke des Umfaltpuffers sind unerlässlich. Mit einer Isopropanol-Waschanlage während der Reinigung konnten wir die Kontaminierung von LPS auf ein sehr niedriges Niveau reduzieren. LPS kann jedoch bei Bedarf durch eine Anionenaustauschsäule weiter reduziert werden.
Diese Technologie kann leicht für den menschlichen Einsatz angepasst werden. Ein bakterielles SAPN wurde bereits für eine bevorstehende klinische Phase 1/2a-Malaria-Studie skaliert.
