Самосборка белковых наночастиц, или SAPNs, может быть использована для разработки вакцин против различных инфекционных заболеваний. Этот метод, который мы описываем здесь, может быть использован для очистки, повторного использования и характеристики SAPNs, содержащих шести-спиральный пучок. Эта наночастица может представлять тримерные антигены в родной конформации.
При небольших изменениях этот метод может быть применен к другим инновационным конструкциям вакцины SAPN. Кроме того, он может быть легко переносим на крупномасштабное производство для клинических испытаний. Для лиза собранного E.coli, выражаюго шести-спиральный пучок SAPN, используйте зонд с выходом звуковой связи 150 Вт с четырьмя секундами звуковой связи и шестью секундами отдыха, чтобы соникатировать перерасход бактериальных гранул в 40 миллилитров буфера без имидазола на льду в течение пяти минут.
Центрифуга клеточного лизата для создания очищенного супернатанта и переноса супернатанта в стерильную 150-миллилитровую колбу. Затем довнесите образец до конечного объема в 100 миллилитров со свежим буфером без имидазола. Чтобы изолировать белок интереса, откройте программное обеспечение FPLC и нажмите на опцию New Method.
В меню «Настройки метода» откройте меню высадки столбца и выберите порт C1 3. В меню высадки по технике выберите Affinity. В меню высадки типов столбцев выберите Другие, HisTrap HP и пять миллилитров.
Объем столбца и коробки давления будут автоматически установлены к соответствующим значениям. Нажмите Нарисуйте описание метода и перетащите кнопки Equilibration и Sample Application, три кнопки Column Wash и кнопку Elution из всплывающего меню Phase Library рядом со стрелкой перед закрытием меню Phase Library. Нажмите Equilibration и установите значения, перечисленные в таблице для первоначального буфера B, 4%Final Buffer B, 4%и Объем столбца, пять.
Нажмите Пример приложения. В коробке загрузки образца нажмите кнопку радиоприемка для инъекционного образца на колонке с помощью образца насоса и подтвердите, что коробка рядом с скоростью потока использования из настроек метода проверяется в коробке образца с системной насосной коробкой. Измените значение коробки Volume до 100 миллилитров и схему сбора фракций для включения.
Отликуй размер фракции использования из коробки настроек метода и измените размер фракции на четыре миллилитра. Нажмите на первую кнопку Column Wash, установите значения, перечисленные в таблице, на initial Buffer B, 4%Final Buffer B, 4%и Column Volume, 10. Нажмите на схему сбора фракций Включите поле и отмять размер фракции использования из настроек метода.
Измените размер фракции на четыре миллилитров и нажмите на вторую кнопку Column Wash. Установите значения в таблице для первоначального буфера B, 0%Final Buffer B, 0%и Объем столбца, пять. Нажмите на схему сбора фракций Включите поле и отмять размер фракции использования из настроек метода.
Измените размер фракции на четыре миллилитров и нажмите на третью кнопку Column Wash. Установите значения в таблице для первоначального буфера B, 0%Final Buffer B, 0%и Объем столбца, 10. Нажмите кнопку Схема сбора фракций Включить и отмять размер фракции использования из коробки настроек метода.
Затем измените размер фракции на четыре миллилитров. Нажмите кнопку Elution и нажмите правой кнопкой мыши на информацию в таблице. В всплывающем меню щелкните Удалите шаг и перетащите кнопку градиента isocratic на стол два раза, так что есть две записи.
Установите значение для первой записи в Initial Buffer B, 30%Final Buffer B, 30%и Объем колонны, 10. Установите значение для второй записи в Initial Buffer B, 100%Final Buffer B, 100%и Объем колонны, 10. Нажмите кнопку «Схема сбора фракций» и нажмите кнопку «Размер фракции использования» из коробки настроек метода.
Затем щелкните Save As и назовите очистку файла. Поместите насос трубки FPLC в буфер мытья без имидазола, и насос B трубки в 500-миллимоляйный буфер имидазола. Поместите образец насоса трубки в 100-миллилитровый образец и запустить программу очистки.
Когда 60%isopropanol мыть необходимо, приостановить программу, переместить насос трубки из имидазола свободной мыть в 60%isopropanol мыть, и перезапустить программу. В конце стирки, приостановить программу еще раз, вернуть насос трубки имидазола свободной мыть буфера, и перезапустить программу очистки. Чтобы оценить чистоту очищенного белка, сначала объединить фракции из потока через, мыть один, мыть два, и мыть три шага, в отдельных 50-миллилитровых конических труб.
Затем смешайте 15 микролитров из каждой пробной трубки с 15 микролитров буфера 2X Laemmli в отдельных 0,5-миллилитровых микроцентрифуговых трубках и денатурировать образцы при 95 градусах Цельсия в течение 10 минут. В конце инкубации, создать гель работает аппарат с тремя пятно-бесплатно четыре до 20%precast полиакриламинид гели в Tris-Глицин SDS-PAGE работает буфер. Загрузите восемь микролитров молекулярного маркера веса к первой скважине каждого геля и 30 микролитров денатурированного образца к другим скважинам.
Запустите гели на 200 вольт, пока краситель фронт хитов нижней части геля и кратко промыть гели с деионизированной водой, прежде чем сразу же изображения с пятном свободной системы изображений. Затем определите фракции, содержащие белковые полосы с правильным размером, и объединить эти фракции. Для шести-спиральный пучок SAPN повторного сфасинга, добавить от 10 до 20 миллилитров слитка белка в 10 килодальтон молекулярного веса отрезаны диализа кассеты.
Диализуйте кассету в восьми молярных мочевинах, 20-миллимолярной трисе, 5%глицероле и пятимимолярной TCEP при комнатной температуре за одну ночь. На следующее утро, уменьшить концентрацию мочевины в буфере диализа stepwise на два моляра каждые два часа, чтобы медленно диализуют мочевину от образца. Когда концентрация мочевины достигнет двух моляров, перемести диализный аппарат до четырех градусов по Цельсию и облизав образец на 120-миллимолярдную мочевину, 20-миллимолярдные три и 5%глицерол на ночь, чтобы закончить развал.
На следующее утро снимите с кассеты слитый белок и отфильтруйте шестислойный пучок SAPN через 0,22-микрометровый фильтр фторида поливинилидена. Чтобы измерить средний размер частиц шестиполетного пучка SAPN, добавьте 45 микролитров шестиполетного пучка SAPN в одноразовый кювет и поместите кюветт в машину DLS. Затем создайте новый файл измерения и запустите заранее написанную стандартную операционную процедуру для белка в 120-миллимоляре мочевины, 20-миллимолярдных три и 5%глицерол буфера при 25 градусах по Цельсию.
Затем начните измерение. Для каждого запуска будет рассчитан средний размер, PDI и результаты распределения. Машина будет читать образец пять раз.
Этот полностью собранный шестислойный пучок SAPN построен на белковых последовательностях, которые, по прогнозам, складываются в частицу, которая содержит 60 копий мономера. Общий лизат клеток был использован для очистки шести-спирали расслоение SAPN мономеров FPLC с помощью колонки никеля, демонстрируя, что белок eluted на обоих 150 и 500-миллимолярновый имидазол. Хроматограмма также показывает два других пика на 185 и 210 миллилитров общего объема, соответствующего изопропанол мыть и имидазол-бесплатно мыть соответственно.
Фракции и чистота рекомбинантного белка могут быть определены градиентом SDS-PAGE гелей с белком интереса в основном расположены в фракции 68 до 79. Западный анализ помарки с антителами anti-His и anti-167D4 показал что соединенные фракции были деиствительно протеином интереса. Помарки также продемонстрировали наличие шести-спирали расслоение SAPN мультимеров.
Образцы, содержащие представляющие интерес, были сложены в полностью собранный шестислойный пучок SAPN путем диализа, а распределение размера частиц определялось анализом DLS и наночастиц. Визуализация с помощью электронной микроскопии передачи выявила хорошо сформироваваемые отдельные шестиу спирали пучка частиц SAPN с распределением размера, полученного из двух методов размера частиц. Наиболее важным шагом в этом протоколе является повторное сфасинг шести-спирали расслоение SAPN.
Правильный рН и ионическая прочность буфера рефолсирования имеют важное значение. Используя изопропанол мыть во время очистки, мы смогли уменьшить загрязняющих LPS до очень низкого уровня. Тем не менее, LPS может быть уменьшена с помощью столбца обмена аниона по мере необходимости.
Эта технология может быть легко адаптирована для применения человеком. Бактериальная выраженная SAPN уже была расширена для предстоящей фазы 1/2a клинических испытаний малярии.
