Este protocolo proporciona un sistema de visualización bacteriana altamente eficaz para el aislamiento de nuevas variantes de BirA que permite la biotinilación específica de proteínas nativas. La principal ventaja de la técnica es que selecciona variantes BirA utilizando selección de streptavidin de alta afinidad. Esto garantiza que se eliminen los clones inactivos, creando así un proceso de selección altamente eficiente.
Para empezar, en un editor de plásmidos, diseñe la imprimación delantera para incluir los últimos 30 nucleótidos del complemento inverso de la secuencia de codificación de péptidos, y agregue la secuencia de nucleótidos de unión al plásmido a su extremo cinco-prime. Diseñe la imprimación inversa para incluir los primeros 30 nucleótidos del complemento inverso de la secuencia de codificación de péptidos, y agregue la secuencia de nucleótidos de unión de plásmido a su extremo de cinco primos. A continuación, para configurar una reacción pcR de 20 microlitros, agregue los reactivos en un tubo de PCR de paredes delgadas.
Transfiera el tubo a un ciclor térmico y realice la PCR según el manuscrito. A continuación, ejecute cinco microlitros de la reacción PCR en un gel de 1% de agarosa para confirmar la amplificación de un producto PCR de seis kilobases, y proceda de acuerdo con el manuscrito. Ahora, para sintetizar las megaprimers mutantes con imprimaciones birA hexahistidina hacia adelante y hacia atrás, en un tubo PCR, agregue un nanograma de pBAD-BirA-eCPX con la secuencia de péptidos de destino preparada como plantilla.
Configurar 35 ciclos de PCR con una temperatura de recocido de 60 grados Celsius de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, ejecute cinco microlitros de la reacción de amplificación en un gel de 1% de agarosa para verificar la amplificación de un producto PCR de par de 984 bases. Purifique el producto PCR de los 45 microlitros restantes de la reacción de amplificación utilizando un kit de purificación de PCR comercial, y utilice un espectrofotómetro para cuantificar el rendimiento del ADN.
En un tubo de PCR de paredes delgadas, agregue los reactivos en las megaprimers mutantes preparadas para preparar la reacción de la muestra. Transfiera la mezcla de reacción a un ciclor térmico y ejecute el PCR de acuerdo con el manuscrito. Almacene la reacción de amplificación a cuatro grados centígrados o sobre hielo.
A continuación, agregue un microlitro de la enzima de restricción Dpn1 directamente a la reacción de amplificación y mezcle suavemente. Gire hacia abajo la mezcla de reacción e incubar durante dos horas a 37 grados centígrados. Después de dos horas, transforme las células E.coli competentes T7 Express lysY/Iq en un tubo con dos microlitros de la reacción Dpn1.
En primer lugar, inocular 100 mililitros de LB que contienen 1%glucosa y 100 microgramos por mililitro de ampolla con un mililitro de la biblioteca BirA, e incubar durante la noche a 37 grados Celsius con temblor a 200 rpm. Luego, inocular cinco mililitros de LB que contienen 1%glucosa y 100 microgramos por mililitro de ampicilina con 100 microlitros del cultivo nocturno. Incubar durante dos horas y 30 minutos o hasta que el cultivo alcance un OD600 de aproximadamente 0,5.
A continuación, inducir la expresión eCPX y BirA con 0.2% de peso por volumen L-arabinose, 100-micromolar IPTG, y 100-micromolar biotina. Agitar el cultivo a 200 rpm durante una hora a 37 grados centígrados. Centrifugar el cultivo durante 10 minutos a 5.000 g, y quitar el sobrenadante.
Resuspender las células en un mililitro de PBS helada, y centrifugar a 5.000 veces g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resuspendir las células en 400 microlitros de PBS helado, y almacenar las células en hielo. Luego, transfiera 10 microlitros de las células resuspendidas a una entrada etiquetada por tubo de 1,5 mililitros.
Almacenar en hielo. A continuación, lave 20 microlitros de perlas magnéticas de estreptavidina en un mililitro de PBS helado en un tubo, y coloque el tubo en un separador de partículas magnéticas de sobremesa durante dos minutos, y retire cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender las perlas magnéticas de estreptavidina en 20 microlitros de PBS helado, y transferir la solución de cuentas a los 390 microlitros preparados anteriormente de células resuspendidas.
Mezclar por pipeteo suave. Luego, incuba durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Coloque una columna con esferas ferromagnéticas en un separador de partículas magnéticas y lave con cinco mililitros de PBS helado.
Transfiera las células y las cuentas magnéticas de estreptavidina del tubo a la columna unida en el separador. Una vez que el depósito de la columna esté vacío, lave la columna con un volumen total de cinco mililitros de PBS helado a 500 microlitros cada vez. Después de eso, retire la columna del separador y colóquela en un tubo de 1,5 mililitros.
Pipetear un mililitro del PBS helado en la columna, y utilizar el émbolo para elir las células etiquetadas magnéticamente. A continuación, coloque el tubo de 1,5 mililitros en un separador de sobremesa y lave la célula etiquetada magnéticamente con un mililitro de PBS helado. Resuspender suavemente las células etiquetadas magnéticamente en un mililitro del PBS helado.
Transfiera 10 microlitros de la resuspensión a una salida etiquetada de tubo de 1,5 mililitros. Inocular 100 mililitros de LB que contienen 1%glucosa y 100 microgramos por mililitro ampolla con las células etiquetadas magnéticamente, e incubar durante la noche a 37 grados celsius con temblor a 200 rpm. Al día siguiente, combinar 10 mililitros del cultivo nocturno en LB con glicerol a una concentración final del 15% y almacenar a menos 80 grados Celsius para hacer existencias de congelador.
Utilice 100 microlitros del cultivo nocturno para la siguiente ronda de selección. Ahora, agregue 990 microlitros de PBS helados a las muestras de entrada y salida, y etiquete la entrada de los tubos 10 a los dos menos y la salida 10 a los dos menos, respectivamente. Realice diluciones seriales de 10 veces de las dos muestras en PBS frío y frío hasta que se alcance una dilución final de 10 a menos 10 en la muestra de entrada y 10 a las menos cuatro en la muestra de salida.
Placa 100 microlitros de muestras de entrada 10 a menos seis, entrada 10 a la menos ocho, entrada 10 a la menos 10, salida 10 a la menos dos, salida 10 a la menos tres, y salida 10 a la menos cuatro en placas individuales de LB-ampicilina, e incubar durante la noche a 37 grados Celsius. Por la mañana, cuente el número de colonias en las placas con colonias claramente separadas. Multiplique el recuento de colonias con el factor de dilución para obtener el recuento de concentración bacteriana por cada 100 microlitros.
En este protocolo, después de la generación de una biblioteca mutada aleatoriamente de variantes BirA, se indujo la expresión BirA y eCPX-AP. Las bacterias fueron incubadas con reactivo de afinidad, las bacterias no atadas fueron desechadas y las bacterias seleccionadas se amplificaron. La mancha occidental de bacterias que expresaban pBAD-BirA-eCPX-AP produjo una banda de 22 kiloptavidinas que reaccionaba consistente con el peso molecular de eCPX tanto en cultivos no inducidos como inducidos.
Sin embargo, no estaban presentes en BirA hexahistidina. La fuerte biotinilación superficial en las bacterias que expresan eCPX-AP causó agregación tras la adición de cuentas magnéticas de estreptavidina y la formación de un pellet en la parte inferior del tubo, que no se observó con eCPX con lisina a bacterias de expresión de mutación de alanina. El análisis del precipitado de la extracción de estreptavidina mostró una banda clara de 22 kiloptavidinas de reacción y anti-hexahistidina en las muestras de cultivos eCPX-AP pero no eCPX-AP con cultivos de mutación de lisina a alanina.
Del mismo modo, el recuento de bacterias unidas a las cuentas de estreptavidina fue significativamente mayor en el eCPX-AP que la lisina eCPX-AP a los cultivos de mutación de alanina. El paso más importante es un lavado estricto de bacterias ligadas a la estreptavidina. Un lavado estricto asegura que solo se seleccionan las bacterias con biotina que se muestra en la superficie.
Una vez que se observa un claro enriquecimiento de bacterias, los clones aislados pueden ser mutados aún más y así desarrollar variantes de BirA altamente activas que permiten la biotinilación específica de proteínas nativas.
