このプロトコルは、ネイティブタンパク質の特異的ビオチン化を可能にするBirAの新しい変異体を単離するための非常に効果的な細菌ディスプレイシステムを提供する。この技術の主な利点は、高親和性ストレプトアビジン選択を使用してBirA変異体を選択することです。これにより、非アクティブなクローンが確実に削除され、高効率な選択プロセスが作成されます。
まず、プラスミドエディタで、ペプチドコード配列の逆補体の最後の30ヌクレオチドを含むようにフォワードプライマーを設計し、プラスミド結合ヌクレオチド配列をその5素端に加える。ペプチドコード配列の逆補体の最初の30ヌクレオチドを含むようにリバースプライマーを設計し、プラスミド結合ヌクレオチド配列をその5素端に加える。次に、20マイクロリットルPCR反応をセットアップし、薄壁PCRチューブに試薬を加えます。
チューブをサーマルサイクラーに移し、原稿に従ってPCRを行います。次に、1%アガロースゲルに対して5マイクロリットルのPCR反応を実行し、6キロベースPCR産物の増幅を確認し、原稿に従って進めます。さて、変異型メガプライマーをビラヘキサヒスチジン前方および逆プライマーで合成し、PCRチューブに、調製した標的ペプチド配列をテンプレートとしてpBAD-BirA-eCPXのナノグラム1個を添加する。
メーカーの指示に従って、60°Cのアニーリング温度で35のPCRサイクルを設定します。次に、1%アガロースゲルで5マイクロリットルの増幅反応を実行し、984塩基対PCR産物の増幅を確認します。市販のPCR精製キットを用いて残りの45マイクロリットルの増幅反応からPCR産物を精製し、分光光度計を使用してDNA収率を定量化します。
薄壁PCRチューブに、調製した変異型メガプライマーに試薬を加えて、サンプル反応を調製する。反応混合物をサーマルサイクラーに移し、原稿に従ってPCRを実行する。増幅反応を摂氏4度または氷の上に保存します。
次に、Dpn1制限酵素の1マイクロリットルを増幅反応に直接加え、穏やかに混ぜます。反応混合物をスピンダウンし、摂氏37度で2時間インキュベートする。2時間後、Dpn1反応の2マイクロリットルを持つチューブ内のT7 Express lysY/Iqの有能な大腸菌細胞を変換します。
まず、1%グルコースを含むLBの100ミリリットルと1ミリリットルのビラライブラリーを用いたアンピシリン1ミリグラムを接種し、200rpmで振ると摂氏37度で一晩インキュベートする。次いで、1%グルコースを含むLBの5ミリリットルを接種し、1ミリリットルのアンピシリン1ミリグラムを100マイクログラムの一晩培養した。2時間30分、または培養液が約0.5のOD600に達するまでインキュベートする。
次に、L-アラビノース、100マイクロモルIPTG、および100マイクロモルビオチンによって0.2%重量でeCPXおよびBirA発現を誘導する。200 rpmで37°Cで1時間、文化を振ります。培養物を5,000回gで10分間遠心し、上清を除去する。
氷冷PBSの1ミリリットルで細胞を再懸濁し、遠心分離機を5,000倍gで5分間再懸濁する。上清を捨て、400マイクロリットルの氷冷PBSで細胞を再懸濁し、細胞を氷の上に保存する。次いで、再懸濁セルの10マイクロリットルを、標識された1.5ミリリットルのチューブに入れて入力します。
氷の上に保管してください。次に、20マイクロリットルのストレプトアビジン磁気ビーズを1ミリリットルの氷冷PBSでチューブで洗浄し、ベンチトップの磁性粒子分離器にチューブを2分間入れ、上清を慎重に取り除きます。20マイクロリットルの氷冷PBS中のストレプトアビジン磁気ビーズを再懸濁し、ビーズ溶液を以前に調製した390マイクロリットルの再懸濁細胞に移す。
軽くピペットで混ぜます。その後、摂氏4度で30分間インキュベートします。磁性粒子分離器に強磁球を持つ柱を置き、5ミリリットルの氷冷PBSで洗浄します。
細胞およびストレプトアビジン磁気ビーズをチューブからセパレータに取り付けられたカラムに移します。カラムリザーバーが空になったら、毎回500マイクロリットルで氷冷PBSの総体積5ミリリットルでカラムを洗います。その後、セパレータからカラムを取り出し、1.5ミリリットルのチューブに入れます。
氷冷PBSのピペットを1ミリリットルのカラムに入れ、プランジャーを使用して磁気標識された細胞を溶出させる。その後、1.5ミリリットルのチューブをベンチトップセパレーターに入れ、磁気標識されたセルを1ミリリットルの氷冷PBSで洗浄します。氷冷PBSの1ミリリットルで磁気標識された細胞を穏やかに再懸濁する。
再懸濁液の10マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに転写して出力します。磁気標識された細胞を用いて1%グルコースと1ミリリットルアンピシリンあたり100マイクログラムを含むLBの100ミリリットルを接種し、200rpmで振ると摂氏37度で一晩インキュベートする。翌日、LBの一晩培養物の10ミリリットルをグリセロールとグリセロールの最終濃度15%に組み合わせ、マイナス80度で保存して冷凍庫の在庫を作ります。
次の選択のラウンドのために一晩培養の100マイクロリットルを使用してください。次に、990マイクロリットルの氷冷PBSを入力サンプルと出力サンプルの両方に加え、チューブ入力10をマイナス2にラベル付けし、出力10をマイナス2にそれぞれラベルを付けます。入力サンプルでマイナス10に10の最終的な希釈に達するまで氷冷PBSで2つのサンプルの10倍の連続希釈を行い、出力サンプルではマイナス4に10倍に達します。
入力10からマイナス6までのサンプルのプレート100マイクロリットル、入力10からマイナス8、マイナス10への入力10、マイナス2への出力10、マイナス3への出力10、個々のLBアンピシリンプレート上のマイナス4に10を出力し、摂氏37度で一晩インキュベートする。朝、明確に分離されたコロニーを持つプレート上のコロニーの数を数えます。コロニー数と希釈係数を掛け合わせ、100マイクロリットル当たりの細菌濃度カウントを求めます。
このプロトコルでは、BirAバリアントのランダムに変異したライブラリの生成後、BirAおよびeCPX-AP発現が誘導された。細菌を親和性試薬でインキュベートし、非結合菌を廃棄し、選択した細菌を増幅した。pBAD-BirA-eCPX-AP発現細菌のウェスタンブロットは、誘導性および誘導培養の両方においてeCPXの分子量と一致する22キロダルトンストレプトアビジン反応バンドを産生した。
しかし、彼らはビラヘキジジンには存在しなかった。eCPX-AP発現細菌における強い表面ビオチン化は、ストレプトアビジン磁気ビーズの添加とチューブの底部のペレットの形成に凝集を引き起こし、これはアラニン突然変異発現細菌にリジンを有するeCPXでは観察されなかった。ストレプトアビジンプルダウンからの沈殿物の分析は、eCPX-AP培養物からのサンプル中に22キロダルトンストレプトアビジン反応および抗ヘキサヒスチジンバンドを明らかにしたが、リジンからアラニン突然変異培養物へのeCPX-APは示さなかった。
同様に、ストレプトアビジンビーズに結合した細菌の数は、アラニン突然変異培養に対するeCPX-APリジンよりもeCPX-APにおいて有意に高かった。最も重要なステップはストレプトアビジン結合細菌の厳格な洗浄である。厳格な洗浄は、表面表示ビオチンを有する細菌のみが選択されることを保証する。
細菌の明確な濃縮が観察されると、単離されたクローンをさらに変異させ、それによって天然タンパク質の特異的なビオチン化を可能にする非常に活性なBirA変異体を開発することができる。
