이 프로토콜은 네이티브 단백질의 특정 생체 자극을 허용하는 BirA의 새로운 변이체를 격리하기 위한 매우 효과적인 세균 디스플레이 시스템을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 높은 친화성 스트렙타비딘 선택을 사용하여 BirA 변형을 선택한다는 것입니다. 이렇게 하면 비활성 복제본이 제거되므로 매우 효율적인 선택 프로세스가 생성됩니다.
시작하려면, 플라스미드 편집기에서, 펩티드 코딩 서열의 역보체의 마지막 30뉴클레오티드를 포함하는 전방 프라이머를 설계하고, 플라스미드 결합 뉴클레오티드 서열을 5-프라임 엔드에 첨가한다. 역프라이머를 설계하여 펩티드 코딩 서열의 역보체의 제30뉴클레오티드를 포함하고, 플라스미드 결합 뉴클레오티드 서열을 5-프라임 엔드에 첨가한다. 그런 다음 20 마이크로리터 PCR 반응을 설정하려면 얇은 벽으로 둘러싸인 PCR 튜브에 시약을 추가합니다.
튜브를 열 사이클러로 옮기고 원고에 따라 PCR을 수행합니다. 다음으로, PCR 반응의 5마이크로리터를 1%아가로즈 젤에 실행하여 6킬로베이스 PCR 제품의 증폭을 확인하고 원고에 따라 진행한다. 이제, 돌연변이 메가프라이머를 BirA hexahistidine 앞뒤로 프라이머로 합성하기 위해 PCR 튜브에서 준비된 표적 펩티드 서열과 함께 pBAD-BirA-eCPX의 나노그램 1나노그램을 템플릿으로 추가한다.
제조 업체의 지시에 따라 60 섭씨 60도의 온도와 35 PCR 사이클을 설정합니다. 이어서, 984염염쌍 PCR 제품의 증폭을 검증하기 위해 1%아가로즈 젤상증폭 반응의 5개의 마이크로리터를 실행한다. 상용 PCR 정제 키트를 사용하여 증폭 반응의 나머지 45 마이크로리터로부터 PCR 제품을 정화하고, 광측계를 사용하여 DNA 수율을 양화한다.
얇은 벽PCR 튜브에서, 샘플 반응을 준비하기 위해 준비된 돌연변이 메가 프라이머에 시약을 추가합니다. 반응 혼합물을 열 사이클러로 옮기고 원고에 따라 PCR을 실행합니다. 증폭 반응을 섭씨 4도 또는 얼음에 저장합니다.
다음으로, 증폭 반응에 Dpn1 제한 효소의 마이크로리터 1개를 직접 넣고 부드럽게 섞습니다. 반응 혼합물을 스핀 다운하고 섭씨 37도에서 2 시간 동안 배양하십시오. 2 시간 후, Dpn1 반응의 두 마이크로 리터와 튜브에서 T7 익스프레스 lysY / Iq 유능한 E.coli 세포를 변환합니다.
첫째, 비르A 도서관의 1 밀리리터와 암피실린 밀리리터 당 1%의 포도당 100 마이크로그램을 함유하고, 200 rpm에서 흔들림과 함께 섭씨 37도에서 하룻밤 을 배양하는 LB의 100 밀리리터를 접종합니다. 그런 다음, 하룻밤 문화의 100 마이크로 리터와 암피실린의 밀리리터 당 1 %의 포도당 100 마이크로 그램을 포함하는 LB의 5 밀리리터를 접종. 2시간 30분 동안 또는 문화가 약 0.5의 OD600에 도달할 때까지 배양합니다.
다음으로, 부피 L-아라비노스, 100 마이크로몰라 IPTG 및 100 마이크로몰러 비오틴에 의해 0.2%의 중량으로 eCPX 및 BirA 발현을 유도한다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 200rpm에서 문화를 흔들어 보시고 있습니다. 5, 000배g에서 10분간 원심분리하고 상체를 제거합니다.
얼음 차가운 PBS의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고, 원심분리기는 5분, 000배 g에서 5분간 반복합니다. 상체를 버리고, 얼음 차가운 PBS의 400 마이크로 리터에 세포를 다시 중단하고, 얼음에 세포를 저장합니다. 그런 다음, 재중단된 세포의 10마이크로리터를 1.5밀리리터 튜브로 전달하여 입력을 표시하였다.
얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 20 마이크로리터의 스티르프타비딘 마그네틱 비즈를 튜브에 얼음-차가운 PBS 1밀리리터로 세척하고, 튜브를 벤치탑 자기 입자 분리기에 2분 동안 배치하고, 상판을 조심스럽게 제거한다. 얼음 차가운 PBS의 20 마이크로 리터에서 스트렙타비딘 자기 구슬을 다시 중단하고, 비드 용액을 이전 390 마이크로리터로 재일시 중단된 세포로 이송한다.
부드럽게 파이펫팅으로 섞는다. 그런 다음 섭씨 4도에서 30 분 동안 배양하십시오. 강자성 구가 있는 컬럼을 자기 입자 분리기에 놓고 얼음차가운 PBS 5밀리리터로 세척합니다.
세포와 연쇄상 구슬을 튜브에서 분리기에 부착된 컬럼으로 옮기다. 기둥 저장소가 비어 있으면 매번 500 마이크로리터에서 총 5밀리리터의 얼음 차가운 PBS로 컬럼을 세척하십시오. 그 후, 분리기에서 컬럼을 제거하고 1.5 밀리리터 튜브에 놓습니다.
파이펫은 얼음차가운 PBS의 1밀리리터를 기둥에 얹고 플런저를 사용하여 자기 라벨이 부착된 세포를 엘로우시합니다. 그런 다음 1.5 밀리리터 튜브를 벤치탑 분리기에 넣고 자기 라벨이 부착된 셀을 얼음차가운 PBS 1밀리리터로 세척합니다. 얼음차가운 PBS의 1밀리리터에서 자기 라벨이 부착된 세포를 부드럽게 재연합니다.
1.5 밀리리터 튜브 라벨 출력으로 리서스펜션의 10 마이크로리터를 전송합니다. 100 밀리리터의 LB는 자기 라벨이 부착된 세포와 함께 밀리리터 암피실린 당 1%의 포도당 100 마이크로그램을 함유하고, 200rpm에서 흔들림과 함께 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 결합 10 글리세롤과 LB에서 하룻밤 문화의 밀리리터를 결합 15%의 최종 농도에 섭씨 영하 80도 냉동고 주식을 만들기 위해 섭씨.
다음 선발을 위해 100 마이크로리터의 야간 문화를 사용하십시오. 이제 입력 및 출력 샘플에 990 마이크로리터의 얼음 차가운 PBS를 추가하고 튜브 입력 10을 마이너스 2로 표시하고 각각 마이너스 2에 10을 출력합니다. 10~10의 최종 희석이 입력 샘플에서 10~10에 도달할 때까지 얼음-차가운 PBS에서 두 샘플의 10배 연속 희석을 하고, 출력 샘플에서 10~4개의 마이너스 4에 도달한다.
100 마이크로리터의 샘플 100 마이크로리터는 입력 10에서 영하 6도까지, 입력 10에서 영하 8개, 입력 10에서 영하 10, 영하 10대 2, 출력 10에서 영하 3개, 출력 10~영하 4도, 그리고 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다. 아침에, 명확하게 분리 된 식민지와 접시에 식민지의 수를 계산합니다. 100 마이크로리터 당 세균 농도 수를 얻기 위해 희석 계수와 콜로니 카운트를 곱한다.
이 프로토콜에서, BirA 변종의 임의로 돌연변이된 라이브러리의 생성 후, BirA 및 eCPX-AP 발현이 유도되었다. 박테리아는 친화성 시약으로 배양되었고, 바운드되지 않은 박테리아는 버려졌고, 선택된 박테리아가 증폭되었다. pBAD-BirA-eCPX-AP 발현 균의 서쪽 얼룩은 유도되지 않은 유도된 배양모두에서 eCPX의 분자량과 일치하는 22킬로달톤 스트렙타비딘 반응 밴드를 생산하였다.
그러나, 그들은 BirA 헥사히스티딘에 존재하지 않았다. eCPX-AP 발현 박테리아의 강한 표면 생체자극은 스테렙타비딘 자기 구슬을 첨가하고 튜브 의 바닥에 펠릿의 형성을 추가하면 응집을 일으켰으며, 이는 알란 돌연변이 발현 박테리아에 리신을 가진 eCPX로 관찰되지 않았다. 스트렙타비딘 풀다운으로부터침을 분석한 결과, eCPX-AP 배양물에서 시료에 명확한 22킬로달톤 스트렙타비딘 반응 및 항 헥사히스티딘 밴드를 표시했지만, 리신을 가진 eCPX-AP는 알란 돌연변이 배양에 대한 리신이 없었다.
유사하게, 스트렙타비딘 비드에 묶인 박테리아의 수는 eCPX-AP에서 알라닌 돌연변이 배양에 대한 eCPX-AP 리신보다 상당히 높았다. 가장 중요한 단계는 연쇄상 구균 바운드 박테리아의 엄격한 세척입니다. 엄격한 세척은 표면이 표시된 비오틴이 있는 박테리아만 선택되도록 보장합니다.
일단 박테리아의 명확한 농축이 관찰되면, 고립 된 클론은 더 돌연변이 될 수 있으며, 따라서 네이티브 단백질의 특정 생체 자극을 허용하는 고도로 활성 BirA 변종을 개발할 수 있습니다.
