Bu protokol, Yerli proteinlerin spesifik biyotinylasyonuna olanak tanıyan Bira'nın yeni varyantlarının izolasyonu için son derece etkili bir bakteriyel teşhir sistemi sağlar. Tekniğin en büyük avantajı, yüksek afinite streptavidin seçimi kullanarak BirA türevlerini seçmesidir. Bu, etkin olmayan klonların kaldırılmasını sağlayarak yüksek verimli bir seçim süreci oluşturur.
Başlamak için, bir plazmid editörü, peptit kodlama dizisinin ters kompleman son 30 nükleotit içerecek şekilde ileri astar tasarımı ve beş asal sonuna plazmid bağlayıcı nükleotit dizisi ekleyin. Ters astarı, peptit kodlama dizisinin ters komplemanının ilk 30 nükleotitini içerecek şekilde tasarlayın ve plazmid bağlayıcı nükleotit dizisini beş asal ucuna ekleyin. Daha sonra, 20 mikrolitrelik PCR reaksiyonu ayarlamak için, ince duvarlı PCR tüpüne reaktifleri ekleyin.
Tüpü bir termal döngüce aktarın ve el yazmasına göre PCR yapın. Daha sonra, altı kilobaz PCR ürün amplifikasyon onaylamak için% 1 agarose jel PCR reaksiyonu beş mikrolitre çalıştırın ve el yazmasına göre devam edin. Şimdi, bir PCR tüp bir Ileri ve ters astarlar ile Mutant megaprimers sentezlemek için, bir şablon olarak hazırlanan hedef peptid dizisi ile pBAD-BirA-eCPX bir nanogram ekleyin.
Üreticinin talimatına göre 60 santigrat derecelik bir sıcaklıkla 35 PCR çevrimayarlayın. Daha sonra, 984 baz çifti PCR ürününün amplifikasyondoğrulamak için %1'lik agarose jelüzerinde amplifikasyon reaksiyonunun beş mikrolitresini çalıştırın. PCR ürününü, ticari bir PCR arıtma kiti kullanarak amplifikasyon reaksiyonunun kalan 45 mikrolitresinden arındırın ve DNA verimini belirlemek için bir spektrofotometre kullanın.
İnce duvarlı bir PCR tüpünde, numune reaksiyonu hazırlamak için hazırlanan mutant megaprimerre reaktifleri ekleyin. Reaksiyon karışımını bir termal döngüce aktarın ve el yazmasına göre PCR'yi çalıştırın. Amplifikasyon reaksiyonu dört santigrat derecede veya buz üzerinde saklayın.
Daha sonra, amplifikasyon reaksiyonu doğrudan Dpn1 restriksiyon enzimi bir mikrolitre ekleyin ve yavaşça karıştırın. Reaksiyon karışımını aşağı çevirin ve 37 derecede iki saat kuluçkaya yatın. İki saat sonra, T7 Express lysY/Iq yetkili E.coli hücrelerini dpn1 reaksiyonunun iki mikrolitresi ile bir tüpte dönüştürün.
İlk olarak, 100 mililitre LB içeren 100 mililitre bir mililitre BirA kütüphanesi ile mililitre ampisilin başına 100 mikrogram, ve 200 rpm sallayarak 37 santigrat derece gecede kuluçka. Daha sonra, bir gecede kültürün 100 mikrolitre ile ampisilin mililitre başına 100 mikrogram glikoz ve 100 mikrogram içeren LB beş mililitre aşılamak. İki saat 30 dakika veya kültür yaklaşık 0,5 od600 ulaşana kadar kuluçka.
Daha sonra, hacim L-arabinose, 100 mikromolar IPTG ve 100 mikromolar biotin tarafından% 0.2 ağırlık ile eCPX ve BirA ekspresyonu indükleyin. 37 santigrat derece bir saat için 200 rpm de kültür shake. 5, 000 kez g 10 dakika için kültür santrifüj ve supernatant kaldırın.
Hücreleri bir mililitre buz gibi PBS'de yeniden askıya alın ve 5,000 kez g'de beş dakika santrifüj yapın. Supernatant atın ve buz gibi PBS 400 mikrolitre hücreleri yeniden askıya ve buz üzerinde hücreleri depolamak. Daha sonra, 1.5 mililitrelik bir tüp giriş etiketli içine resuspended hücrelerin 10 mikrolitre aktarın.
Buzda saklayın. Daha sonra, bir tüpte bir mililitre buz gibi PBS'de 20 mikrolitre streptavidin manyetik boncukyı yıkayın ve tüpü iki dakika boyunca bir tezgah üstü manyetik parçacık ayırıcıya yerleştirin ve süpernatantı dikkatlice çıkarın. 20 mikrolitre buz gibi PBS'deki streptavidin manyetik boncuklarını yeniden askıya alın ve boncuk çözeltisini önceki hazırlanmış 390 mikrolitre resuspended hücrelere aktarın.
Yavaşça pipetleme ile karıştırın. Sonra, 4 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yat. Bir manyetik parçacık ayırıcı içinde ferromanyetik küreler ile bir sütun yerleştirin ve buz gibi PBS beş mililitre ile yıkayın.
Hücreleri ve streptavidin manyetik boncukları tüpten ayırıcıya bağlı kolona aktarın. Sütun haznesi boşaldıktan sonra, her seferinde 500 mikrolitre buz gibi PBS toplam hacmi ile sütunu yıkayın. Bundan sonra, ayırıcıdan sütunu çıkarın ve 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.
Pipet sütun üzerine buz gibi PBS bir mililitre, ve manyetik etiketli hücreleri eute için piston kullanın. Daha sonra, 1,5 mililitrelik tüpü bir tezgah üstü ayırıcıya yerleştirin ve manyetik olarak etiketlenmiş hücreyi bir mililitre buz gibi PBS ile yıkayın. Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri buz gibi pbs'nin bir mililitresinde yavaşça askıya alın.
10 mikrolitre resuspension'yi 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. 100 mililitre LB içeren 100 mililitre mililitre ampisilin başına mililitre ampisilin içeren manyetik etiketli hücrelerle ve 200 rpm'de sallayarak bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, gliserol ile LB gecede kültürün 10 mililitre birleştirmek 15%son konsantrasyonve dondurucu stokları yapmak için eksi 80 santigrat derecede saklamak.
Bir sonraki seçim turu için gece kültürünün 100 mikrolitresini kullanın. Şimdi, hem giriş hem de çıkış örneklerine 990 mikrolitre buz gibi PBS ekleyin ve tüplerin girişini eksi ikiye 10 ve çıktıyı eksi ikiye 10 olarak etiketleyin. Giriş örneğinde 10 ila eksi 10 ve çıkış örneğinde eksi dörde 10'a ulaşana kadar buz gibi PBS'deki iki numunenin 10 kat seri seyreltmesini yapın.
100 mikrolitre numune nin girişi 10'dan eksi altıya, giriş 10'dan eksi sekize, giriş 10'dan eksi 10'a, çıkış 10'dan eksi ikiye, çıkış 10'dan eksi üçe ve tek tek LB-ampisilin plakalarında eksi dörde 10 çıkış ve bir gecede 37 santigrat derece kuluçkaya yat. Sabah, açıkça ayrılmış koloniler ile plakalar üzerinde kolonilerin sayısını saymak. 100 mikrolitre başına bakteri konsantrasyonu sayısını elde etmek için koloni sayısını seyreltme faktörüyle çarpın.
Bu protokolde, BirA varyantları, BirA ve eCPX-AP ifade rasgele mutasyona uğramış bir kütüphane nesil sonra indüklendi. Bakteriler yakınlık reaktifi ile kuluçkaya yatırıldı, bağlanmamış bakteriler atıldı ve seçilen bakteriler güçlendirildi. PBAD-BirA-eCPX-AP'nin bakterileri ifade eden batı daki blot'u, hem indüklenmemiş hem de indüklenen kültürlerde eCPX'in moleküler ağırlığına uygun 22 kilodalton streptavidin-reacting band üretti.
Ancak, BirA heksahistidine mevcut değildi. ECPX-AP'de bakterileri ifade eden güçlü yüzey biyotinylasyonu, streptavidin manyetik boncukların eklenmesi ve tüpün alt kısmında bir pelet oluşumu üzerine biraraya neden oldu, alanine mutasyon ekspresyonu bakterilere lizin ile eCPX ile gözlenmemiş. Streptavidin çekilmesinden çökelti analizi, eCPX-AP kültürlerinden alınan örneklerde 22 kilodalton streptavidin-reacting ve anti-heksahistidin bandı gösterdi, ancak eCPX-AP ile lizin ile alaninmutasyon kültürlerine kadar.
Benzer şekilde, streptavidin boncuklarına bağlı bakteri sayısı eCPX-AP'de alanin mutasyon kültürlerine göre eCPX-AP lizinden anlamlı olarak daha yüksekti. En önemli adım streptavidin bağlı bakterilerin sıkı bir yıkama olduğunu. Sıkı bir yıkama sadece yüzey görüntülenen biotin ile bakteri seçilir sağlar.
Bakterilerin net bir zenginleştirme gözlendikten sonra, izole klonlar daha da mutasyona uğrayabilir ve böylece yerli proteinlerin spesifik biyotinylation için izin son derece aktif BirA varyantları geliştirmek.
