Este protocolo fornece um sistema de exibição bacteriana altamente eficaz para o isolamento de novas variantes de BirA que permite a biotiningação específica de proteínas nativas. A principal vantagem da técnica é que ela seleciona variantes BirA usando a seleção streptavidin de alta afinidade. Isso garante que os clones inativos sejam removidos, criando assim um processo de seleção altamente eficiente.
Para começar, em um editor plasmídeo, projete o primer dianteiro para incluir os últimos 30 nucleotídeos do complemento reverso da sequência de codificação de peptídeos, e adicione a sequência de nucleotídeos de ligação plasmida à sua extremidade de cinco primes. Projete o primer reverso para incluir os primeiros 30 nucleotídeos do complemento reverso da sequência de codificação de peptídeos e adicione a sequência de nucleotídeos de ligação plasmida à sua extremidade cinco-prime. Em seguida, para configurar uma reação PCR de 20 microliter, adicione os reagentes em um tubo PCR de paredes finas.
Transfira o tubo para um ciclo-de-tempo térmico e execute PCR de acordo com o manuscrito. Em seguida, execute cinco microliters da reação pcr em um gel de 1%agarose para confirmar a amplificação de um produto PCR de seis quilobases, e prossiga de acordo com o manuscrito. Agora, para sintetizar os megaprimers mutantes com hexahistidina bira para a frente e primers invertidos, em um tubo PCR, adicione um nanograma de pBAD-BirA-eCPX com a sequência de peptídeos de destino preparado como um modelo.
Configure 35 ciclos de PCR com uma temperatura de 60 graus Celsius de acordo com a instrução do fabricante. Em seguida, execute cinco microliters da reação de amplificação em um gel de 1%agarose para verificar a amplificação de um produto PCR de par de 984 bases. Purifique o produto PCR dos 45 microliters restantes da reação de amplificação usando um kit comercial de purificação pcr, e use um espectógrafo para quantificar o rendimento do DNA.
Em um tubo PCR de paredes finas, adicione os reagentes nos megaprimers mutantes preparados para preparar a reação da amostra. Transfira a mistura de reação para um cicloviário térmico e execute o PCR de acordo com o manuscrito. Armazene a reação de amplificação a quatro graus Celsius ou no gelo.
Em seguida, adicione um microliter da enzima de restrição Dpn1 diretamente à reação de amplificação e misture suavemente. Gire a mistura de reação e incubar por duas horas a 37 graus Celsius. Após duas horas, transforme células E.coli competentes T7 Express/Iq em um tubo com dois microliters da reação dpn1.
Primeiro, inocular 100 mililitros de LB contendo 1%glicose e 100 microgramas por mililitro de ampicillina com um mililitro da biblioteca BirA, e incubar durante a noite a 37 graus Celsius com tremor a 200 rpm. Em seguida, inocular cinco mililitros de LB contendo 1%de glicose e 100 microgramas por mililitro de ampicillina com 100 microliters da cultura da noite para o dia. Incubar por duas horas e 30 minutos ou até que a cultura atinja um OD600 de aproximadamente 0,5.
Em seguida, induzir a expressão eCPX e BirA com 0,2% de peso em volume L-arabinose, 100 micromolar IPTG e biotina de 100 micromolar. Agite a cultura a 200 rpm por uma hora a 37 graus Celsius. Centrifugar a cultura por 10 minutos a 5.000 vezes g, e remover o supernaspe.
Resuspend as células em um mililitro de PBS gelado, e centrífuga a 5.000 vezes g por cinco minutos. Descarte o supernascer, e resuspenja as células em 400 microliters de PBS gelado, e armazene células no gelo. Em seguida, transfira 10 microliters das células resuspended em uma entrada rotulada de tubo de 1,5 mililitro.
Guarde no gelo. Em seguida, lave 20 microliters de contas magnéticas streptavidin em um mililitro de PBS gelado em um tubo, e coloque o tubo em um separador de partículas magnéticas de bancada por dois minutos, e remova cuidadosamente o supernascer. Resuspend as contas magnéticas streptavidin em 20 microliters de PBS gelado, e transfira a solução de contas para os 390 microliters previamente preparados de células resuspended.
Misture suavemente a pipetação. Em seguida, incubar por 30 minutos a quatro graus Celsius. Coloque uma coluna com esferas ferromagnéticas em um separador de partículas magnéticas, e lave com cinco mililitros de PBS gelado.
Transfira as células e as contas magnéticas streptavidin do tubo para a coluna anexada no separador. Uma vez que o reservatório da coluna esteja vazio, lave a coluna com um volume total de cinco mililitros de PBS gelado a 500 microliters cada vez. Depois disso, remova a coluna do separador e coloque-a em um tubo de 1,5 mililitro.
Pipeta um mililitro do PBS gelado na coluna, e use o êmbolo para elutar as células magneticamente rotuladas. Em seguida, coloque o tubo de 1,5 mililitro em um separador de bancada, e lave a célula magneticamente rotulada com um mililitro de PBS gelado. Levemente resuspenque as células magneticamente rotuladas em um mililitro do PBS gelado.
Transfira 10 microlitres da ressuspensão para uma saída de tubo de 1,5 mililitro. Inocular 100 mililitros de LB contendo 1%glicose e 100 microgramas por ampicillina mililitro com as células magneticamente rotuladas, e incubar durante a noite a 37 graus Celsius com agitação a 200 rpm. No dia seguinte, combine 10 mililitros da cultura da noite para o dia em LB com glicerol a uma concentração final de 15% e armazene a menos 80 graus Celsius para fazer estoques congeladores.
Use 100 microliters da cultura da noite para a próxima rodada de seleção. Agora, adicione 990 microliters de PBS gelados às amostras de entrada e saída, e rotule a entrada dos tubos 10 para os menos dois e saída 10 para o menos dois, respectivamente. Faça diluições seriais de 10 vezes das duas amostras em PBS gelado até que uma diluição final de 10 para o menos 10 seja alcançada na amostra de entrada e 10 a menos quatro na amostra de saída.
Placa 100 microliters de amostras de entrada 10 a menos seis, entrada 10 para o menos oito, entrada 10 para menos 10, saída 10 para menos dois, saída 10 para menos três, e saída 10 para menos quatro em placas individuais LB-ampicillin, e incubar durante a noite a 37 graus Celsius. Pela manhã, conte o número de colônias nas placas com colônias claramente separadas. Multiplique a contagem da colônia com o fator de diluição para obter a contagem de concentração bacteriana por 100 microliters.
Neste protocolo, após a geração de uma biblioteca aleatoriamente mutada de variantes BirA, a expressão BirA e eCPX-AP foi induzida. As bactérias foram incubadas com reagente de afinidade, bactérias não ligadas foram descartadas e bactérias selecionadas foram amplificadas. A mancha ocidental de bactérias expressas pBAD-BirA-eCPX-AP produziu uma banda de reação de streptavidina de 22 quilodalton consistente com o peso molecular do eCPX em culturas não induzidas e induzidas.
No entanto, eles não estavam presentes na hexahistidina bira. A forte biotintilação superficial nas bactérias expressas eCPX-AP causou agregação após a adição de contas magnéticas streptavidinas e a formação de uma pelota na parte inferior do tubo, que não foi observada com eCPX com liseina para bactérias de expressão de mutação alanina. A análise do precipitado da pulldown streptavidin mostrou uma faixa clara de 22 kilodalton streptavidin-reacting e anti-hexahistidina nas amostras das culturas eCPX-AP, mas não eCPX-AP com lise para culturas de mutação alanina.
Da mesma forma, a contagem de bactérias ligadas às contas de streptavidina foi significativamente maior no eCPX-AP do que a lise eCPX-AP para culturas de mutação alanina. O passo mais importante é uma lavagem rigorosa de bactérias ligadas ao streptavidin. Uma lavagem rigorosa garante que apenas bactérias com biotina exibida pela superfície sejam selecionadas.
Uma vez observado um claro enriquecimento de bactérias, os clones isolados podem ser ainda mais mutados e, assim, desenvolver variantes de BirA altamente ativas que permitem a biotiningação específica de proteínas nativas.
