Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Western Ontario, el Departamento de Obstetricia y Ginecología, y una donación ER06-02-188 de la Investigación y la Innovación Ministryof, Premio al Investigador temprana. MMD fue apoyada por un programa de capacitación CIHR en la reproducción, el desarrollo temprano y el Impacto en la Salud de Becas de Posgrado (REDIH).

DIA 1 Prepare las siguientes soluciones frescas en el día de la recogida de ovocitos con agua destilada estéril, como el agua GIBCO. Para reducir el riesgo de contaminación de ADN, cambiar los guantes con frecuencia y utilizar puntas con filtro. Mantener tubos ángulo lejos cuando está abierto, y recapitular todos los tubos cuando no esté en uso. Se recomienda que las soluciones se hacen como n +1. 3% de agarosa LMP Punto 30 mg de fusión bajo (LMP) de agarosa hasta 1 ml GIBCO H 2 O disolver @ 70 ° C Solución de lisis 8 l de buffer de lisis 1 l de proteinasa K 1 l IGEPAL 10% lugar en hielo hasta que esté listo para su uso 02:01 agarosa: solución de lisis (10 l por persona de ovocitos, la cantidad es de 3 ovocitos) 20 l 3% de agarosa LMP 10 Solución de Lisis l mezclar @ 70 ° C SDS Lysis de búfer (501 l por persona ovocito) <table border="0"><tbody><tr><td> 1x TE pH 7,5 </td><td> 450 l </td></tr><tr><td> 10% de SDS </td><td> 50 l </td></tr><tr><td> Proteinasa K </td><td> 1 l </td></tr><tr><td></td><td> 501 l </td></tr></tbody></table> 1. Recolección de los ovocitos <ol><li> Coloque los oviductos de ratones disecados en los medios de comunicación M2, y romper la ampolla para extraer el complejo de células del cumulus. </li><li> Separar los oocitos a partir del complejo de células cúmulos utilizando 0,3 mg / ml de solución de hialuronidasa en una caída de 30 l de medios M2. Mantenga los ovocitos en solución sólo durante el tiempo que sea necesario para eliminar las células del cumulus, ya que la exposición prolongada puede dañar. Lave los ovocitos 3x en 30 l de los medios de comunicación caída de M2, la eliminación de las células del cumulus periódicamente. </li><li> Retire la zona pelúcida con solución ácida de Tyrode. Coloque los ovocitos en un 30 l de solución de gota, y luego transferir a otros 30gota l, como cualquier medio llevadas a lo largo va a diluir el ácido y reducir su eficacia. Mantenga los ovocitos en solución sólo durante el tiempo que sea necesario para eliminar la zona, como la exposición prolongada puede dañar. Nota: un aumento de la concentración de la solución ácida de Tyrode o pronasa puede ser utilizado para muestras humanas, como la humana zona pelúcida es más resistente al tratamiento con una solución ácida de Tyrode que el ratón. </li><li> Lavar los oocitos una vez más en una caída de 30 l de medios M2. </li></ol> 2. Incorporación de agarosa y Lysis <ol><li> Para realizar la incrustación de agarosa, poner la solución de lisis en un 70 heatblock ° C. Añadir el precalentado agarosa LMP a la solución de lisis, produciendo una agarosa 2:1: solución de lisis. </li><li> Coloque un único ovocito en un portaobjetos de vidrio limpio en medio mínimo M2. Tomar hasta 10 l de la agarosa: solución de lisis en una punta de la pipeta, y (bajo un microscopio) suavemente expulsar una pequeña cantidad (~ 1 l o menos) sobre el portaobjetos de vidrio, permitiendo que se mezcle con la mínimaAl medios de comunicación. Suavemente levante el ovocito en la punta de la pipeta y poner todo l 10 en un tubo Eppendorf con 300 l de aceite mineral por lo que el cordón forma una esfera. Nota: este proceso debe hacerse con bastante rapidez como la agarosa se endurecerá si la temperatura desciende por lo menos 5 ° C por debajo de 70 ° C. </li><li> Incubar el tubo en hielo durante 10 minutos. Para llevar a cabo la lisis, quitar el aceite mineral de 300 l, y añadir 500 l de la solución amortiguadora de lisis SDS. Incubar toda la noche en un baño de agua a 50 ° C. Nota: La solución de lisis (Tabla 1) también se pueden utilizar para este propósito. </li></ol> DÍA 2 Preparar las siguientes soluciones frescas en el día de mutagénesis bisulfito. Para reducir la posibilidad de contaminación de ADN, cambiar los guantes con frecuencia y utilizar puntas con filtro. Mantener tubos ángulo lejos cuando está abierto, y recapitular todos los tubos cuando no esté en uso. Se recomienda que las soluciones se hacen como n +1. <table border="0"><tbody><tr><td> 3 M de NaOH </td> &lt;td&gt; 2,4 g de NaOH en 20 ml autoclave ddH2O </td></tr><tr><td> 0,1 M de NaOH </td><td> 0,5 ml de 3M en 14,5 ml autoclave ddH2O </td></tr><tr><td> 0,3 M de NaOH </td><td> 1,5 ml de 3M en 13,5 ml autoclave ddH2O </td></tr></tbody></table> 2,5 M solución de bisulfito <ol class="lalpha"><li> 3,8 g de bisulfito de sodio 5,5 ml GIBCO H 2 O destilada 1 ml de 3 M de NaOH disolver @ temperatura ambiente </li><li> 110 mg de hidroquinona 1 ml GIBCO H 2 O destilada disolver @ 90 ° C (sólo durante el tiempo que sea necesario para disolver, mezclar con regularidad) </li></ol> Cuando está completamente disuelto, mezclar la solución (a) y (b) * Manténgase alejado de la luz * 3. Bisulfito de Mutagénesis <ol><li> Totalmente eliminar el tampón 500 l lisis SDS y añadir 300 l de aceite mineral (~ 20 horas). Cualquier tampón de lisis restante se diluya ªe agarosa cuando se calienta y el cordón será más susceptible a la disolución en los pasos subsiguientes. Proceda con bisulfito de mutagénesis de inmediato, o tienda a -20 ° C durante un máximo de 5 días. </li><li> Si procede, extraiga los ovocitos del congelador y dejar descongelar (sólo hasta agarosa al grano es relativamente transparente). Incubar durante 2,5 minutos en un bloque de 90 ° C de calor, después de lo cual Incubar en hielo durante 10 minutos. Nota: No mezclar o revolver, se extienden más de 2,5 minutos, o variar la temperatura. </li><li> Para llevar a cabo la desnaturalización, eliminar el aceite mineral y se añade 1 ml de NaOH 0,1 M a cada tubo, película e invierta 5-6 veces. </li><li> Incubar durante 15 minutos en un baño de agua a 37 ° C, invirtiendo cada 3-4 minutos. El talón debe flotar en el NaOH. </li><li> Para realizar el tratamiento de bisulfito, hacer girar el tubo suavemente, luego retire el NaOH y añadir 300 l de aceite mineral y 500 solución de bisulfito de l. Incubar el tubo durante 3,5 horas en un baño de agua a 50 ° C. * Mantenga alejado de la luz * </strong&gt; Nota: Longitud de la incubación puede necesitar ser determinado empíricamente para el gen de interés. </li><li> Para llevar a cabo desulfonation, incubar en hielo durante 3 minutos, luego retire el aceite mineral y la solución de bisulfito, girar suavemente, y se añade 1 ml de 0,3 M de NaOH. Flick e invertir 5-6 veces. </li><li> Incubar durante 15 minutos en un baño de agua a 37 ° C, invirtiendo cada 3-4 minutos. El talón debe flotar en el NaOH. </li><li> Lávese las muestras, en primer lugar, girando con suavidad, luego retire el NaOH y añadir 1 ml de TE 1x pH 7,5. Agitar durante 5-10 minutos a temperatura ambiente (en un agitador). Haga girar suavemente de nuevo, a continuación, quitar el TE 1x. Repita este proceso de lavado dos veces. </li><li> Añadir 1 ml de autoclave ddH 2 O. Agitar durante 5-10 minutos a temperatura ambiente (en un agitador). Haga girar suavemente, a continuación, retire el H 2 O. Repita el lavado ddH 2 O dos veces. </li><li> Comprobar el pH del sobrenadante, sino que debe ser 5,0 pH. Si todavía muy básica, lavar otra vez con H 2 O. Retire todo el sobrenadante, dejando sólo la agarosa esanuncio. </li></ol> 4. 1 ª y 2 ª ronda de amplificación por PCR <ol><li> Preparar 1 ª ronda de PCR ** mezcla mientras se lava ** </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 10 mM adelante externo Primer </td><td> 0,5 l </td></tr><tr><td> 10 mM Inversa cebador externo </td><td> 0,5 l </td></tr><tr><td> 240 ng / ml de ARNt </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 13 l </td></tr></tbody></table> Añadir a Illustra cuentas Ready-to-Go Hot Start PCR Deslice con cuidado el sólido cordón de agarosa en el tubo de PCR (~ 10 l) Calentar a 70 ° C y la mezcla Añadir 25 l de aceite mineral Total: 50 l <ol start="2"><li> Ampliar Nota: Un ejemplo de ciclismo condiciones para ratón SNRPN es desnaturalización durante 2 minutos a 94 ° C, seguido por 40 ciclos de 30 segundos a 94 ° C, 1 minuto a 50 ° C, y 1minutos a 68 ° C, y un final de 10 minutos paso de elongación a 68 ° C. Recocido temperatura durante 1 ª ronda de PCR para el ratón H19 y Peg3 es de 50 ° C. </li><li> Prepare 2 ª ronda de PCR mezcla </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 10 mM Adelante Interior Primer </td><td> 0,5 l </td></tr><tr><td> 10 mM cebador inverso interior </td><td> 0,5 l </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 19 l </td></tr></tbody></table> Añadir a Illustra cuentas Ready-to-Go Hot Start PCR Añadir 5 l 1 producto redondo pt como una plantilla. Calentar el producto 1 ª ronda a 70 ° C durante 1 minuto para ablandar la agarosa. Asegúrese de que la pipeta por debajo de la capa de aceite mineral. Añadir 25 l de aceite mineral Total: 50 l Nota: las secuencias anidadas de imprimación para SNRPN, H19, y Peg3 se pueden encontrar en el mercado Velker et al 10,12. <ol start="4"><li> Ampliar Nota: Ciclismo condiciones para el ratón SNRPN es desnaturalización durante 2 minutos a 94 ° C, seguido por 40 ciclos de 30 segundos a 94 ° C, 1 minuto a 50 ° C, y 1 minuto a 68 ° C, y una elongación final 10 minutos paso a 68 ° C 10. Ratón H19 y Peg3 requieren un 50 ° C la temperatura de recocido para 2 ª ronda de PCR. </li><li> Como una prueba de diagnóstico, la segunda ronda muestras puede ser cortado con una enzima de restricción que es la metilación o cepa específica. </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 2 ª Ronda del producto </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> Enzima de restricción </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> Buffer </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 4 l </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> Electroforesis los productos de digestión en un gel de acrilamida al 8%. Las bandas heterogéneas representan más de un Sequena vez. </li></ol> 5. La clonación y la asistencia técnica de PCR colonia <ol><li> Para clonar 2 ª producto redondo, calor primero a 70 ° C durante 1 minuto para ablandar la agarosa, a continuación, ligante en el vector usando la Promega vector pGEM-T del sistema (Fisher Scientific Cat. # A1360). </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 2 ª ronda de PCR </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> pGEMT-fácil vector </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> Ligasa </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> Tampón de ligación 2x </td><td> 5 l </td></tr></tbody></table> Incubar toda la noche @ 4 ° C en máquina de PCR. <ol start="2"><li> Descongele competentes células de E. coli en hielo durante 15 minutos (Zymo Investigación Cat Corp # T3009). Añadir 3 l de reacción de ligación a 8 l E. coli y la ligadura se incuba en hielo durante 15 minutos. </li><li> De choque térmico durante 40 segundos en un baño de agua a 42 ° C,y se incuba en hielo durante 2 minutos. Añadir 60 l medio SOC y se incuba a 37 ° C durante 1 hora (en coctelera). </li><li> Coloque toda la mezcla de reacción sobre una placa LB / agar / IPTG / Xgal / Amp y la placa se incuba a 37 ° C durante la noche. </li><li> Prepare la mezcla de PCR de colonias </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 20 mM M13 cebador </td><td> 0,7 l </td></tr><tr><td> 20 mM M13 cebador inverso </td><td> 0,7 l </td></tr><tr><td> Go Green 5X buffer Taq </td><td> 7,0 l </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP </td><td> 0,7 l </td></tr><tr><td> Taq ADN polimerasa </td><td> 0,28 l </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 25,62 l </td></tr><tr><td></td><td> 35 Total l </td></tr></tbody></table> Añadir 35 l colonia PCR Master Mix en un tubo de PCR. Elija una colonia de bacterias de la placa blanca con una punta de la pipeta, y se arremolinan en la reacción de PCR. <ol start="6"><li> Amplificar con desnaturalización durante 10 minutos a 94 ° C, seguido por 30 ciclos de 45 segundos a 94 ° C, 30 segundos a 57 ° C, y 1 minuto a 72 ° C, y un paso final 10 minutos de elongación a 72 ° C. 4 l electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%. Enviar ~ 30 l del producto de PCR para la secuenciación. Nota: Para obtener los ovocitos, 5 colonias de los productos de PCR se secuenciaron. </li><li> Una vez que los resultados de la secuenciación se obtienen, los patrones de metilación puede ser leído. Cualquier CG original que se mantuvo como un centro de gravedad fue metilado, y cualquier CG original que ahora es un TG se unmethylated. </li></ol> 6. Los resultados representativos En nuestro trabajo, prueba de metilación impresa en ovocitos y embriones individuales (Figura 1). Tras anidada amplificación por PCR utilizando cebadores bisulfito convertidos, es posible confirmar una conversión con éxito mediante la visualización de un tamaño de fragmento correcto en un gel de agarosa (Figura 2). Un oocito individuorepresenta uno de los alelos de los padres, y, en teoría, tiene un patrón de metilación impresa. Como tal, la segunda ronda los productos de PCR puede hacerse la prueba de la contaminación accidental. Una enzima de restricción sensible a la metilación del ADN (tales como HinfI o DpnII) se puede utilizar para digerir el producto segunda ronda de PCR para evaluar si contiene un alelo metilado o no metilado (Figura 3). A metilado dentro de la secuencia de reconocimiento de la enzima se escinde mientras un C unmethylated que se convierte a T ya no es reconocido por la enzima y es sin cortar. Cualquier muestra que contenga tanto oocitos MII metilado y alelos metilados debe ser desechado, ya que es indicativa de contaminación cúmulos de células (Figura 3). Después de la ligación y transformación, colonia éxito amplificación por PCR puede ser visualizada en un gel de agarosa para asegurar las muestras con el tamaño correcto del producto se envían para la secuenciación (Figura 4). Finalmente, la secuencia de cinco cl individuolos de un ovocito MII debe producir cinco patrones de metilación idénticos y las mismas tasas de conversión nonCpG (Figura 5A). Todas las muestras que contienen más de un patrón debe desecharse (Figura 5b). Desde ovuladas oocitos MII tienen dos copias del cromosoma o un cuerpo polar adjunto, hay una posibilidad para la obtención de dos patrones de secuencia similar (Figura 5c). Se recomienda descartar los datos a partir de ovocitos que tienen los patrones de metilación muy disímiles ya que la contaminación de cúmulos de células que no se puede descartar. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema del ensayo de mutagénesis único ovocito bisulfito. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig2.jpg" /> Figura 2. Los resultados representativos de amplificación de 2 ª ronda para SNRPN de un cantarLe MII ovocitos en un 1,5% en gel de agarosa. Los carriles 1-4 son cuatro individuales ovocitos MII y el carril 5 es un control negativo (sin oocito). Tamaño esperado del amplicón de 420 pb es SNRPN. L, escalera. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig3.jpg" /> Figura 3. Los resultados representativos de 2 ª ronda digestión de restricción metilación específica para SNRPN de una sola oocitos MII en un gel de acrilamida al 8%. Digestión HinfI restricción diagnóstico muestra de ADN metilado que alberga una T que suprime el sitio de restricción (420bp, calle 1) o ADN metilado que contiene un sitio de reconocimiento dentro de C (corte, 262, 103, y 54 pb, calle 2). La digestión que muestra los sitios de restricción tanto metilado y unmethylated enzima bandas cortadas y sin cortar, carril 3) son indicativos de contaminación cúmulos de células. L, escalera. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig4.jpg" /> Figura 4. </strong&gt; Los resultados representativos para la colonia de la amplificación por PCR de SNRPN de un solo ovocito MII en un 1,5% en gel de agarosa. Tamaño esperado del amplicón después de la ligadura de SNRPN en el vector pGEM-T Easy y el uso de M13 adelante y atrás primers es 656 pb. Carril 1-8, 1-8 amplicones de los clones. Clon 5 tiene un tamaño de amplificación incorrecta y no deben ser enviados para la secuenciación. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig5.jpg" /> Figura 5. Representante de secuenciación resultados para SNRPN de un solo ovocito MII. SNRPN es metilado en los ovocitos. Los círculos negros indican metilado CpGs. Los círculos blancos indican unmethylated CpGs. Número de CpG y la colocación es representativo de un ratón B6 cepa femenino. a) Se espera los resultados de secuenciación de SNRPN de un solo ovocito MII. Sólo una sola hebra de ADN se amplifica en los cinco clones. Los ovocitos con un patrón de metilación sola y misma no CpG golpeteo de conversiónn deben ser incluidos en los análisis (porcentaje de conversión de los no CpGs indica a la derecha se calculó como el número de no-CpG citosinas convertidos a timina como un porcentaje del total de no-CpG citosinas). b) Secuenciación de los resultados de SNRPN de un solo ovocito MII con la contaminación de células del cumulus. Tenga en cuenta la disimilitud entre los estados y los patrones de metilación de conversión que indica la amplificación cadena múltiple. c) La secuenciación resultados para SNRPN de un solo ovocito MII con las copias de cromosomas o la inclusión tanto de cuerpo polar.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Este ensayo contiene un solo ovocito muchos pasos con un número que son críticas y requieren un cuidado especial. El primero es el lavado de los ovocitos. Es particularmente importante para lavar cada oocito varias veces en medio fresco cae después del tratamiento hialuronidasa para eliminar las células cumulus como sea posible. Por otra parte, cuando la transferencia de ovocitos a la solución ácida de Tyrode para la zona pelúcida asegurarse de la eliminación medio circundante está libre de células del cumulus...

Tabla de los reactivos y equipos específicos. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td colspan="4"> Recolección de los ovocitos </td></tr><tr><td> Hialuronidasa </td><td> Sigma </td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td> Ácida de Tyrode </td><td> Sigma </td><td> T1788 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinasa K </td><td> Sigma </td><td> P5568 </td><td></td></tr><tr><td> 10% IGEPAL </td><td> Bioshop </td><td> NON999.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Solución de lisis </td></tr><tr><td> Tris pH 7,5 </td><td> Bioshop </td><td> TRS001.5 </td><td></td></tr><tr><td> LiCl </td><td> Sigma </td><td> L9650 </td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> EDTA pH 8,0 </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> LiDS </td><td> Bioshop </td><td> LDS701.10 </td><td></td></tr><tr><td> TDT </td><td> Invitrogen </td><td> P2325 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Tampón de lisis SDS </td></tr><tr><td> TE pH 7,5 </td><td> Bioshop (Tris) Sigma (EDTA) </td><td> TRS001.5 E5134 </td><td></td></tr><tr><td> 10% de SDS </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Bisulfito de conversión </td></tr><tr><td> Hidróxido de sodio </td><td> Sigma </td><td> S8045 </td><td></td></tr><tr><td> De sodio bisulfito (bisulfito de sodio) </td><td> Sigma </td><td> 243973 </td><td>; </td></tr><tr><td> La hidroquinona </td><td> Sigma </td><td> H9003 </td><td></td></tr><tr><td> Bajo punto de fusión (LMP) de agarosa </td><td> Sigma </td><td> A9414 </td><td></td></tr><tr><td> Aceite mineral </td><td> Sigma </td><td> M8410 </td><td></td></tr><tr><td> Medio M2 </td><td> Sigma </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> GIBCO Agua destilada </td><td> Invitrogen </td><td> 15230-196 </td><td></td></tr><tr><td> Autoclave de doble destilada (DD) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> PCR </td></tr><tr><td> Illustra Hot Start Mix RTG </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9006-54 </td><td></td></tr><tr><td> 240 ng / ml de tRNA de levadura </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td></td></tr><tr><td> 5x verde GoTaq tampón de reacción </td><td> ProMega </td><td> M7911 </td><td></td></tr><tr><td> Cebadores internos y externos </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Ligadura </td></tr><tr><td> Promega pGEM-T Easy Vector </td><td> Fisher Scientific </td><td> A1360 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Cloning TA </td></tr><tr><td> Células de E. coli competentes </td><td> Zymo Research Corp. </td><td> T3009 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Equipo </td></tr><tr><td> Microscopio de disección </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 70 ° C y 90 ° C Bloques de calor </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C y 50 ° C, tanque de agua (42 ° C para las transformaciones) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mecedora </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Máquina de PCR </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single oocyte bisulfite mutagenesis

La epigenética abarca todos hereditarias y las modificaciones reversibles a la cromatina que la accesibilidad alter gen, y por lo tanto son los principales mecanismos para la regulación de la transcripción de genes 1. Metilación del ADN es una modificación epigenética que actúa sobre todo como una marca represivo. A través de la adición covalente de un grupo metilo a las citosinas en dinucleótidos CpG, se puede contratar a otras proteínas de represión y modificaciones de las histonas para iniciar procesos involucrados en la condensación de la cromatina y el silenciamiento de genes 2. Metilación del ADN es esencial para el desarrollo normal, ya que desempeña un papel fundamental en la programación del desarrollo, la diferenciación celular, la represión de elementos retrovirales, la inactivación del cromosoma X y la impronta genómica. Uno de los métodos más poderosos para el análisis de la metilación del ADN es la mutagénesis bisulfito. Bisulfito de sodio es un mutágeno ADN que desamina citosinas en uracilos. Tras la amplificación por PCR y Seque<html> ncing, estos eventos de conversión se detectan como timinas. Citosinas metiladas están protegidos de la desaminación y por lo tanto permanecen como citosinas, que permita la identificación de la metilación del ADN en el nivel individual de nucleótidos 3. Desarrollo del ensayo mutagénesis bisulfito ha avanzado de las originalmente presentadas 4-6 hacia los que son más sensibles y reproducibles 7. Un avance clave fue incrustar pequeñas cantidades de ADN en un cordón de agarosa, protegiendo así el ADN del tratamiento bisulfito dura 8. Este análisis de metilación habilitado para llevar a cabo en las piscinas de los ovocitos y blastocitos, embriones de 9. El protocolo de mutagénesis bisulfito de los más sofisticados hasta la fecha es de cada etapa de blastocisto, embriones de 10. Sin embargo, puesto que los blastocistos tienen un promedio de 64 células (que contiene 120-720 pg de ADN genómico), este método no es eficaz para los estudios de metilación en oocitos individuales o embriones etapa de escisión. tienda &quot;&gt; Tomando pistas de la incrustación de agarosa de las cantidades de ADN minutos incluyendo 11 ovocitos, aquí se presenta un método por el cual los ovocitos están directamente incrustado en una solución de agarosa y lisis cordón de recuperación inmediatamente después y la eliminación de la zona pelúcida del ovocito. Esto nos permite pasar por alto los dos principales retos de la mutagénesis sola bisulfito de ovocitos:. la protección de una pequeña cantidad de ADN de la degradación y la pérdida subsecuente durante los pasos del protocolo numerosos importante, ya que los datos se obtienen a partir de ovocitos individuales, el problema del sesgo de PCR en las piscinas se elimina otra. , contaminación inadvertida célula cúmulo es detectable por este método, puesto que cualquier muestra con patrón de metilación más de un pueden ser excluidos de análisis 12. Este protocolo proporciona un método mejorado para el análisis de éxito y reproducible de la metilación del ADN en el nivel de una sola célula y se adapta idealmente de oocitos individuales, así como embriones en estado de división.

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Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Bisulfito de mutagénesis es el estándar de oro para el análisis de la metilación del ADN. Nuestro protocolo modificado permite el análisis de metilación del ADN en el ámbito de una sola célula y fue diseñado específicamente para los ovocitos individuales. También se puede utilizar para los embriones etapa de escisión.

Único ovocito Mutagénesis bisulfito

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K vistas.  Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario. Bisulfito de mutagénesis es el estándar de oro para el análisis de la metilación del ADN. Nuestro protocolo modificado permite el análisis de metilación del ADN en el ámbito de una sola célula y fue diseñado específicamente para los ovocitos individuales. También se puede utilizar para los embriones etapa de escisión.

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Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Mutagénesis dirigida casera de plásmidos enteros

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Investigación

Biología

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

Introducción al Laboratorio de Worm: El cultivo de gusanos de Mutagénesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagénesis y funcional protocolos de selección de la evolución dirigida de proteínas en E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

La microinyección de ovocitos de ratón, Maduración y Evaluación de ploidía

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

La<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovocitos-Cut abierta vaselina Gap Técnica Voltage-clamp Con Fluorometría

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

Generación de<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU auxótrofos Usando transposón mutagénesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

Un protocolo para la evaluación funcional de la Proteína Total-mutagénesis de saturación Bibliotecas La utilización de secuenciación de alto rendimiento

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of assisted reproduction techniques such as oocyte in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF) and cloning of domestic animals by nuclear transfer from somatic cell. IVM is the method particularly of significance. It is the platform technology for the supply of mature, good quality oocytes for applications such as reduction of the generation interval in commercially important or endangered species, research concerning in vitro human reproduction, and production of transgenic animals for cell therapies. The term oocyte quality includes its competence to complete maturation, be fertilized, thereby resulting in healthy offspring. This means that oocytes of good quality are paramount for successful fertilization including IVF procedures. This poses many difficulties to develop a reliable culture method that would support growth not only of human oocytes but also of other large mammalian species. The first step in IVM is the in vitro culture of oocytes. This work describes two protocols for the 3D culture of porcine oocytes. In the first, 3D model cumulus-oocyte complexes (COCs) are encapsulated in a fibrin-alginate bead interpenetrating network, in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. In the second one, COCs are suspended in a drop of medium and encapsulated with fluorinated ethylene propylene (FEP; a copolymer of hexafluoropropylene and tetrafluoroethylene) powder particles to form microbioreactors defined as Liquid Marbles (LM). Both 3D systems maintain the gaseous in vitro culture environment. They also maintain COCs 3D organization by preventing their flattening and consequent disruption of gap junctions, thereby preserving the functional relationship between the oocyte, and surrounding follicular cells.

Presented here are two protocols for the encapsulation of porcine oocytes in 3D culture conditions. In the first, cumulus-oocyte complexes (COCs) are encapsulated in fibrin-alginate beads. In the second, they are enclosed with fluorinated ethylene propylene powder particles (microbioreactors). Both systems ensure optimal conditions to maintain their 3D organization.

Hidrogeles de Alginato degradados proteolíticamente y microbiorreactores hidrófobos para encapsulación de oocitos porcinos

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops worldwide. Since adult fruit flies have great flight capacity and females lay their eggs under the skins of fruit, insecticides requiring direct contact with the pest usually perform poorly in the field. With the development of molecular biological tools and high-throughput sequencing technology, many scientists are attempting to develop environmentally friendly pest management strategies. These include RNAi or gene editing-based pesticides that downregulate or silence genes (molecular targets), such as olfactory genes involved in searching behavior, in various insect pests. To adapt these strategies for Oriental fruit fly control, effective methods for functional gene research are needed. Genes with critical functions in the survival and reproduction of B. dorsalis serve as good molecular targets for gene knockdown and/or silencing. The CRISPR/Cas9 system is a reliable technique used for gene editing, especially in insects. This paper presents a systematic method for CRISPR/Cas9 mutagenesis of B. dorsalis, including the design and synthesis of guide RNAs, collecting embryos, embryo injection, insect rearing, and mutant screening. These protocols will serve as a useful guide for generating mutant flies for researchers interested in functional gene studies in B. dorsalis.

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

This paper presents the step-by-step protocols for CRISPR/Cas9 mutagenesis of the Oriental fruit fly Bactrocera dorsalis. Detailed steps provided by this standardized protocol will serve as a useful guide for generating mutant flies for functional gene studies in B. dorsalis.

Protocolos para la mutagénesis CRISPR/Cas9 de la mosca oriental de la fruta Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, which is known as cellular heterogeneity. In recent years, single-cell and cell-type isolation combined with next-generation sequencing (NGS) techniques have become important tools for studying biological processes at single-cell resolution. However, isolating plant cells is relatively more difficult due to the presence of plant cell walls, which limits the application of single-cell approaches in plants. This protocol describes a robust procedure for fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based single-cell and cell-type isolation with plant cells, which is suitable for downstream multi-omics analysis and other studies. Using Arabidopsis root fluorescent marker lines, we demonstrate how particular cell types, such as xylem-pole pericycle cells, lateral root initial cells, lateral root cap cells, cortex cells, and endodermal cells, are isolated. Furthermore, an effective downstream transcriptome analysis method using Smart-seq2 is also provided. The cell isolation method and transcriptome analysis techniques can be adapted to other cell types and plant species and have broad application potential in plant science.

The feasibility and effectiveness of high-throughput scRNA-seq methods herald a single-cell era in plant research. Presented here is a robust and complete procedure for isolating specific Arabidopsis thaliana root cell types and subsequent transcriptome library construction and analysis.

Análisis de aislamiento y transcriptoma de tipos de células vegetales

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...