La neurodenegación en muchos trastornos neurológicos es un proceso crónico del cual la pérdida de fibra neuronal a menudo ocurre antes de la pérdida del cuerpo celular. La cuantificación estereológica de las fibras neuronales en tres dimensiones proporciona un método sensible y preciso para detectar el cambio neurodegenerativo temprano. Esta tecnología utiliza el fraccionamiento imparcial fiable y eficiente basado en computadora de bolas espaciales para medir las longitudes de las estructuras de línea como las fibras neuronales en 3D.
La demostración del procedimiento será realizada por Prabhakar Singh, un post-doc y nuestro experto en estereología, y David Peng, el asistente de investigación en mi laboratorio. Después de confirmar una falta de respuesta al reflejo del pedal en el ratón anestesiado, perfunda transcardiariamente con aproximadamente 50 mililitros de DPBS molar 0,1 frío helado, seguido de aproximadamente 25 mililitros de 4%PFA en 0,1 MOLar PBS. Al final de la perfusión, después de fijar el cerebro en un recipiente de 4%PFA fresco durante 24 horas a cuatro grados centígrados.
Al día siguiente, lave el cerebro con tres lavados de uno a dos minutos en DPBS frescos por lavado y transfiera el cerebro a una sacarosa del 15% en una solución de 0.1 DPBS durante la noche. A la mañana siguiente, coloque el cerebro en una solución de 30% de sacarosa y 0,1 DPBS molar durante 48 horas a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, transfiera el cerebro a una cámara de criotomo preestilada a menos 20 grados centígrados.
Los cerebros se pueden mantener en tubos sellados y almacenarse a menos 80 grados centígrados. Para la sección, incruste la muestra de tejido en un medio de incrustación de temperatura de corte óptimo y monte la muestra en un disco de muestra. A continuación, adquiera secciones de 30 micrómetros de espesor en serie en un plano coronal en el criotomo, transfiriendo cada sección a pozos individuales de una placa de cultivo de 24 pozos que contiene solución crioprotectora en preparación para un almacenamiento de menos 20 grados centígrados.
Para identificar la primera y la última sección de cada cerebro, compare las características morfológicas con un atlas de cerebro de ratón estándar. NBM comienza en bregma menos 0.0 milímetros y termina en menos 1.6 milímetros. La selección de cada octava sección produce un total de seis a siete secciones y permite un coeficiente de error adecuado para una estimación de volumen y longitud de fibra.
Para el etiquetado inmunohistoquímico de las secciones del tejido, después de bloquear cualquier unión no específica con un suero bovino 10%normal en 0,1%Tritón X-100 en solución salina tamponada Tris, etiquete las secciones con el anticuerpo primario de interés durante 48 horas a cuatro grados Celsius. Al final de la incubación, lave las secciones tres veces durante tres minutos en solución salina fresca tamponada Tris por lavado, seguida de incubación con un anticuerpo secundario biotinilado adecuado durante una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave las secciones tres veces en solución salina fresca tamponada Tris como se demuestra, seguida de tinción con complejo de biotina peroxidasa de Avidina y solución de sustrato de peroxidasa DAB de acuerdo con los protocolos del fabricante.
Después del lavado, monte todas las secciones de una muestra de tejido cerebral en un portaobjetos gelatinizado y permita que las muestras se sequen al aire. Para deshidratar las secciones, sumerja las muestras dos veces durante cinco minutos por dilución en soluciones secuenciales ascendentes de etanol como se indica, seguidas de la limpieza con dos lavados de xileno de 10 minutos. A continuación, utilice un medio de montaje adecuado para colocar los cubreobjetos en las diapositivas.
Para la estereología, abra un nuevo estudio en el software. Se abrirá un cuadro de diálogo de inicialización del estudio. Rellene la información del estudio y confirme que se ha seleccionado la opción basada en fracciones de varios niveles.
Haga doble clic en el volumen para abrir el cuadro de diálogo de volumen. Asigne un nombre a la entidad de interés y seleccione el sondeo de recuento de puntos de región y haga clic en Siguiente. Haga doble clic en longitud y proporcione un nombre de la operación.
Seleccione la sonda de esfera y haga clic en Siguiente. En el cuadro de inicialización del caso, para codificar los grupos antes de iniciar el estudio, establezca el número total de secciones que comienzan desde la primera sección que contiene el área de interés hasta la última sección que contiene el área de interés y el intervalo de muestreo de sección en ocho. Haga clic junto a la opción para abrir el cuadro de diálogo de inicialización del sondeo, que establecerá automáticamente la ampliación más baja para la selección de región y la estimación del volumen y confirmará la configuración.
Haga clic en vista previa para comprobar si la región de interés se puede identificar en la ampliación inferior seleccionada. Introduzca 50.000 micrómetros de cubo por punto para la fracción de volumen de región y haga clic en vista previa y listo. En el aumento alto del objeto, establezca la longitud en 63X y la longitud de doble clic para abrir el cuadro de diálogo de la esfera de longitud.
Establezca el diámetro de esta esfera en 10 micrómetros y haga clic en hecho. Establezca los valores adecuados para el área del marco, la altura del marco, la zona de protección y el espaciado del marco. A continuación, haga clic en siguiente y siga las instrucciones proporcionadas por el software.
Para insertar la primera sección, coloque la diapositiva en la etapa del microscopio bajo un objetivo 5X y haga clic en la flecha verde para dibujar un límite arbitrario alrededor del NBM para definir la región de interés. Haga clic en la flecha verde y listo para cambiar el objetivo 63X para obtener las mediciones de fibra de la fracción actual. Aparecerá el cuadro de diálogo Grosor de sección.
Establezca la superficie superior e inferior de la sección para medir el grosor real de la sección utilizando la perilla de enfoque manual del eje z y haga clic en hecho. Mueva el eje z lentamente de arriba a abajo en la altura del marco de la sección para marcar todas las fibras que se intersecan en la superficie de la sonda de esfera virtual. Cuando todas las fibras se hayan marcado, haga clic junto para avanzar a la siguiente ubicación.
Cuando se hayan completado todas las fracciones, haga clic en la flecha verde. El software le pedirá que se inserte la siguiente sección. Ponga la siguiente muestra en la diapositiva en el foco usando el objetivo 5X y repita la medición de fibra como acaba de demostrar.
Una vez medidas todas las secciones, el software generará un resultado para el caso que muestra el coeficiente de valores de error. Si el coeficiente de error es aceptable, proceda al siguiente caso. Si el coeficiente de error no es aceptable, el software proporcionará recomendaciones para cambiar algunos de los parámetros.
Cuando se hayan completado todos los casos, genere resultados para cada caso y grupo. En este experimento representativo, el grupo de proteínas precursoras de amiloide beta mutante sueco demostró una longitud de fibra significativamente menor y densidad de longitud de fibra en comparación con sus compañeros de basura de tipo salvaje. Los resultados también mostraron que no había ninguna diferencia significativa en el volumen del NBM entre los dos grupos analizados.
Esta técnica requiere la adquisición adecuada en la orientación correcta y un buen método de tinción con el período de incubación. El protocolo de estereología se puede utilizar para la estimación de cualquier perfil lineal como otras fibras neuronales, procesos de astrocitos o incluso perfiles vasculares.
