Los métodos actuales de análisis de cilios son laboriosos y propensos a errores y sesgos. Nuestro enfoque busca optimizar el tiempo y el esfuerzo al tiempo que mitiga los posibles errores. La principal ventaja que ofrece esta técnica es el aumento del rigor y la reproducibilidad y el análisis cuantitativo de imágenes.
Este tipo de enfoque no solo es relevante para el análisis de cilios, sino que también se puede aplicar ampliamente a muchas cuestiones biológicas celulares, incluidas las relacionadas con otros orgánulos y proteínas citoesqueléticas. Para comenzar, abra el conjunto de datos de entrenamiento, seleccione el archivo en el menú, haga clic en importar exportación y seleccione crear archivo ND a partir de la secuencia de archivos. Seleccione la carpeta que contiene el conjunto de datos de entrenamiento y la lista de archivos se abrirá en el centro de la ventana de diálogo.
Defina manualmente la organización de los archivos utilizando al menos una opción en el menú desplegable. Introduzca los valores numéricos correspondientes debajo de cada opción seleccionada y seleccione ninguna donde las opciones no estén seleccionadas. Haga clic en convertir para abrir el documento ND.
Para calibrar la imagen, haga clic con el botón derecho en la opción no calibrada en la esquina inferior izquierda de la imagen. Haga clic en Calibrar documento, luego haga clic en tamaño de píxel, ingrese el valor y haga clic en Aceptar. Seleccione los controles de análisis de vista, abra la barra de herramientas binaria y seleccione detectar automáticamente o dibujar objetos para identificar a mano los cilios rastreando con precisión las estructuras ciliares individuales en todos los marcos abiertos.
Para entrenar la IA, seleccione nis. ai, haga clic en segmento de tren. ai para abrir el segmento del tren.
ai y luego seleccione el canal de origen que se utilizará para el entrenamiento. Seleccione los binarios de GroundTruth apropiados para entrenar a la IA. Seleccione el número requerido de iteraciones para entrenar la IA en función del tamaño binario y la distribución, luego seleccione la carpeta de destino para guardar el archivo de IA entrenado y haga clic en entrenar para entrenar el software. Este proceso dura varias horas.
Abra las imágenes confocales experimentales de los cilios como se describió anteriormente convirtiendo la muestra. TIF a archivos ND2. En la ventana emergente, seleccione multipunto en el primer menú desplegable e introduzca un valor correspondiente al número total de imágenes.
En el segundo cuadro desplegable, seleccione longitud de onda y cambie el valor al número total de canales de la carpeta. El software desbloqueará automáticamente una ventana de selección de longitud de onda, ubicada en la parte inferior, extremo derecho de la ventana emergente. En la ventana de selección de longitud de onda, utilice el menú desplegable de color para seleccionar el color de cada canal.
Proporcione a cada canal un nombre diferente en la columna de nombre. Una vez que se actualice toda la información, haga clic en convertir. Calibre las imágenes como se describió anteriormente.
Asegúrese de que el tamaño de píxel del conjunto de datos experimental sea coherente con el del conjunto de datos de entrenamiento. Identifique los cilios en el primer canal utilizando la IA entrenada del paso anterior. Abrir nis.
ai en el menú, seleccione segmento. ai y, a continuación, seleccione AC3 en los canales de origen. A continuación, identifique los cilios en el segundo canal seleccionando MCHR1 en los canales de origen.
El software dibujará binarios en los cilios etiquetados. A continuación, verifique las imágenes en busca de binarios mal identificados. Seleccione eliminar objeto en la barra de herramientas binaria para eliminar manualmente los binarios mal identificados.
Una vez identificados y segmentados los cilios, analizar diferentes parámetros de los cilios, como longitudes e intensidades, utilizando la herramienta de análisis general tres. Seleccione la imagen en el menú y haga clic en la nueva receta GA3. Se abrirá una nueva ventana con un espacio en blanco en el centro.
GA3 detectará automáticamente los binarios debidamente etiquetados de acuerdo con la IA e incluirá el nodo correspondiente. GA3 también detectará automáticamente los canales en las imágenes y mostrará sus pestañas debajo de los canales. La IA segmentará todos los cilios como objetos en el marco y detectará cilios incompletos a lo largo de los bordes del marco.
Para eliminarlos, seleccione procesamiento binario, quite objetos y, a continuación, arrastre el nodo de bordes táctiles al espacio en blanco y conecte el nodo a los binarios apropiados. Para medir la longitud de los cilios, seleccione tamaño del objeto de medición y, a continuación, longitud. Arrastre y suelte el parámetro en el centro y conéctese al nodo binario apropiado.
Para medir las intensidades de los cilios, seleccione alguna intensidad de objeto. Arrastre y suelte el parámetro al centro y conéctese al nodo binario apropiado y al canal de interés. En el menú de medición, vaya a la ratiometría de objetos y seleccione el coeficiente de Mander para configurar la vía de colocalización en GA3 midiendo la superposición de dos canales dentro de los cilios individuales.
Arrastre y suelte el nodo de coeficiente de Mander en el espacio en blanco y conéctelo al binario y los canales apropiados. ApEn las mediciones y la tabla única abriendo el menú de gestión de datos. En la categoría básica, seleccione la columna ApEn y, a continuación, haga clic en Ejecutar ahora para medir los cilios.
Todas las mediciones aparecerán en una sola tabla de salida. Las imágenes representativas muestran que la IA entrenada identificó adecuadamente los cilios in vitro en las imágenes de células IMCD, cultivos hipotalámicos primarios y cultivos de hipocampo, pero no otras estructuras no ciliares como los puentes citocinéticos. La longitud de los cilios varió de 0,5 a 4,5 micrómetros en las células IMCD y de dos a 12 micrómetros en el cultivo hipotalámico y del hipocampo.
La IA midió las longitudes de los cilios marcados con AC3 in vivo en las imágenes de nuestras regiones de núcleo arqueado, núcleo paraventricular y cornu ammonis one. Según el análisis, los cilios hipotalámicos in vivo oscilaron entre uno y 15 micrómetros, como se ve en las barras blancas y marrones. Mientras que los cilios y la región de cornu ammonis variaron de uno a 10 micrómetros, como se ve en las barras grises.
Curiosamente, la intensidad del MCHR1 ciliar fue más fuerte en el núcleo paraventricular que en el núcleo arqueado. Las intensidades de MCHR1 contra AC3 se trazaron para medir su superposición. La mayoría de los cilios fueron positivos para ambos marcadores, mientras que algunos cilios fueron positivos para AC3 o MCHR1.
Para cuantificar la colocalización de MTHR1 dentro de AC3, se midió el coeficiente de superposición de Mander y hubo un aumento significativo en la superposición en el núcleo paraventricular que en el núcleo arqueado. Para medir la intensidad a lo largo de la longitud de los cilios, se definió la polaridad de los cilios utilizando Centrin2-GFP como marcador basal del cuerpo. Esto permitió distinguir la base de los cilios de las puntas de los cilios positivos de cereza ARL13B-M.
Se observaron cambios en la intensidad de ARL13B a lo largo de la longitud de los cilios donde la intensidad de ARL13B fue mayor en la base que en la punta del cilio en el núcleo arqueado, visto a la izquierda, así como PVN, como se ve a la derecha. Al analizar datos con este enfoque, es importante asegurarse de que la calidad y la resolución del conjunto de datos experimentales sean consistentes con las utilizadas para entrenar a la IA. La principal utilidad de este enfoque es que después de detectar cilios por IA, el usuario puede ser creativo sobre qué propiedades se analizan personalizando el flujo de trabajo de análisis integrado dentro del software.
