Este protocolo permite la evaluación de la integridad sináptica en la cóclea del jerbo de todas las edades. Esto es importante para la investigación fundamental sobre los problemas de audición, en particular, debido al envejecimiento. El protocolo es relativamente rápido y produce datos cuantitativos de varias ubicaciones a lo largo de la cóclea.
Además, aborda un problema específico del envejecimiento del tejido mediante el uso de un silenciador de autofluorescencia. La degeneración de las sinapsis es el signo más temprano de pérdida de función en la cóclea. Cuantificarlo es una herramienta importante en la investigación hacia el desarrollo de herramientas de diagnóstico no invasivas para la sinaptopatía.
La disección coclear es la parte más crucial que necesita práctica, por lo que es mejor comenzar con cocleíes no experimentales. Comience por quitar las ampollas. Cortar el hueso con tijeras o romper el hueso con fórceps y retirarlo con fórceps para llegar a la cóclea.
Retire el malleus, el incus y los canales semicirculares. Retire con cuidado el hueso que cubre el ápice de la cóclea y rasque el hueso coclear con fórceps para hacer pequeños agujeros en el ápice y en el giro basal o haga agujeros con cuidado en ambos lugares. Transfiera inmediatamente las ampollas a al menos 50 mililitros de fijador frío.
Para cortar el cochli por la mitad, coloque un trozo de cuchilla de afeitar más largo que la longitud enrollada de la cóclea en un soporte de cuchilla. Luego, coloque la cóclea en una placa de Petri bajo un microscopio estereoscópico. Corte el exceso de tejido con una cuchilla de afeitar o con tijeras finas.
Sostenga la cóclea en su lugar con fórceps finos y córtela por la mitad a lo largo del modiolus. Prepare una solución al 5% del calmante de autofluorescencia mezclándolo con etanol al 70%. Coloque el cochli en esta solución e incube durante un minuto a temperatura ambiente en un agitador seguido de lavar tres veces con un mililitro de PBS durante cinco minutos.
Para la disección de la cóclea, recoja dos pinzas finas, pinzas súper finas, vannas, tijeras de resorte, un soporte de cuchilla, una hoja de afeitar y llene la placa de Petri de poliestirol y su tapa con PBS. Rompe piezas de la cuchilla de afeitar para obtener una superficie de corte de dos a cuatro milímetros. Corte la cóclea por la mitad como se muestra en la sección para la preparación del tejido.
Fije cuidadosamente la mitad coclear con las pinzas de tal manera que el borde cortado esté orientado hacia arriba. Use tijeras finas de resorte para cortar el hueso de la cóclea por encima del helicotrema que cubre el ápice. Luego, use tijeras para aislar el giro apical cortando a través del modiolus y el nervio auditivo y los vestibuli de la scala.
Haga dos cortes a cada lado del hueso coclear por encima, o si la estría vascular no es necesaria para una evaluación adicional, directamente a través de la estría vascular del giro medio. Usa la hoja de afeitar para separar las piezas cocleares. Alternativamente, corte entre el órgano de Corti y la estría vascular.
Deje la estría vascular conectada al ligamento espiral y retire el hueso descalcificado con fórceps. A continuación, transfiera las piezas cocleares a una tapa de placa de Petri llena de PBS. Retire el exceso de tejido en el pilar y los lados modiolares de modo que todos los soportes se queden más tarde en la corredera lo más plano posible.
Las piezas cocleares grandes, en particular, las que se originan en el giro basal, deben cortarse en dos pedazos. Retire con cuidado la membrana tectorial con pinzas súper finas. Coloque las piezas cocleares en una diapositiva en una gota de medio de montaje, asegurándose de que el Órgano de Corti esté hacia arriba.
Desplace la pieza coclear hacia el plano sagital y busque la invaginación del limbo espiral muy cerca de las células ciliadas internas. Esta invaginación del limbo espiral se puede ver más claramente en las piezas cocleares medias y basales. Transfiera toda la cóclea y toda la estría vascular al portaobjetos del microscopio repitiendo estos pasos.
Cubra el deslizamiento de la diapositiva y agregue esmalte de uñas negro alrededor de los bordes para el sellado. Secar en la oscuridad y almacenarlos a cuatro grados centígrados. Abra una copia de las pilas descontorneadas en el software ImageJ cargado con el complemento BioVoxxel.
Divida los canales haciendo clic en Imagen, luego en Color y luego en Dividir canales. Combínalos haciendo clic en Imagen, luego en Color y luego en Combinar canales para asignar diferentes colores. Convierta la imagen en una pila RGB haciendo clic en Imagen, luego vaya a Color y haga clic en Pila a RGB.
Ajuste el brillo y el contraste haciendo clic en Imagen, Ajustar y, a continuación, Brillo/Contraste. Use auto o control deslizante para asegurarse de que las estructuras pre y postsinápticas y las etiquetas internas de las células ciliadas sean distintas del fondo. Etiquete cinco células ciliadas internas con la herramienta de texto haciendo clic en la ubicación deseada dentro de la pila.
A continuación, vaya a Analizar, luego a Herramientas y seleccione ROI Manager. Marque las etiquetas de las casillas de verificación para etiquetar los puntos con un número. Haga zoom en la célula ciliada interna de interés.
Haga clic derecho en la herramienta de punto para elegir el modo multipunto. Desplácese por la dimensión Z y cuente las sinapsis funcionales de la cinta, que se identifican mediante una cinta presináptica en yuxtaposición a un parche de glutamato postsináptico. Después de seleccionar todas las estructuras de interés, haga clic en Agregar el Administrador de ROI, luego haga clic en el nombre arbitrario y elija Cambiar nombre.
Con la herramienta manual, ajuste la imagen para mostrar completamente la siguiente célula ciliada interna. Cambie de la herramienta Multipunto a la herramienta Punto para evitar agregar más puntos a los datos almacenados anteriormente. Haga clic en una estructura de interés dentro de la siguiente célula ciliada interna y cambie a la herramienta Multipunto.
Continúe agregando la sinapsis de cinta funcional en el ROI Manager hasta que se evalúen todas las células ciliadas internas. Haga clic en un conjunto de datos en el Administrador de ROI y luego en Medir. Espere a que aparezca una nueva ventana que enumere los puntos de datos medidos y haga clic en Archivo y Guardar como para guardar esta lista como una hoja de cálculo.
Guarde la imagen activando Mostrar todo en el Administrador de ROI. Haga clic en Aplanar para agregar permanentemente las etiquetas de punto a la pila y haga clic en Aceptar cerrar guardando los cambios. Las proyecciones de la pila Z de la cóclea de un jerbo joven de 10 meses de edad muestran que las células ciliadas internas marcadas con miosina 7A delineadas aquí por líneas discontinuas blancas estaban en marcado contraste con el fondo.
Las cintas presinápticas se etiquetaron con anti-CtBP2 dos que se muestran en verde, mientras que los parches de glutamato post-sináptico se etiquetaron con anti-GluA2 que se muestra en rojo. La cóclea de un viejo jerbo de 38 meses fue tratada con el bloqueador de autofluorescencia y mostró distintas células ciliadas internas con estructuras pre y postsinápticas claramente visibles. Para probar la estabilidad del inmunoetiquetado, se tomó la imagen de la misma pieza de cóclea del jerbo joven después de tres meses y 29 meses y medio.
A pesar de la reducción de la relación señal-ruido, las sinapsis funcionales eran distintas y cuantificables. Incluso si un corte falla, monte la pieza restante de tejido para luego estimar la longitud coclear completa con mayor precisión. Los datos de este protocolo son particularmente valiosos si están precedidos por, y luego correlacionados individualmente con, pruebas de audición electrofisiológicas o psicofísicas.
