Los SNX-BAR son proteínas de remodelación de membranas que desempeñan un papel clave en las enfermedades humanas. Utilizando nuestros métodos, podemos determinar sus propiedades biofísicas precisas para facilitar la unión de lípidos y la remodelación de la membrana. La purificación de las proteínas SNB-BAR de las células de levadura permite la adquisición de dimers nativos homo y hetero SNX-BAR, minimizando al mismo tiempo la toxicidad y la insolubilidad que se encuentran con frecuencia con los sistemas de expresión no nativos.
Nuestros métodos se pueden utilizar para comprender las especificidades lipídicas de todas las levaduras SNX-BAR o para producir proteínas SNX-BAR recombinantes de cualquier otro organismo. Un conjunto correcto del extrusor es esencial para prevenir la pérdida de liposomas durante el proceso de extrusión. Para los estudiantes principiantes o los nuevos en el campo, observar visualmente los pasos más críticos mejorará en gran medida sus posibilidades de éxito.
Comience por inocular un gran hisopo de células de levadura en un matraz al menos cuatro veces el volumen del cultivo que contiene 50 mililitros de medio YP estándar complementado con 2%raffinosis y 0.1%glucosa como fuente de carbono y crecer el cultivo durante la noche en un shaker de 30 grados Celsius. A la mañana siguiente, inocular el preculero de 50 mililitros en un litro de medio YP estándar con 2% de rafinosa y 0,1% de glucosa en un matraz Fernbach desconfiado de volumen de 2,8 litros para un cultivo de cuatro a cinco horas en la incubadora de temblores. Cuando la densidad óptica a 600 nanómetros alcance 0,2, agregue gatactosa a una concentración final del 2% a las células para un cultivo nocturno en la incubadora de temblores.
A la mañana siguiente, cosecha las células por centrifugación y transfiere el pellet de levadura a un tubo cónico de 50 mililitros. Resuspender el pellet en 15 mililitros de tampón de purificación para lograr un volumen final de unos 30 mililitros y cargar la suspensión celular en un homogeneizador refrigerado a cuatro grados centígrados. Lyse las muestras a 20 a 25,000 libras por pulgada cuadrada para dos a tres rondas y transferir el lysate en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo.
Limpie inmediatamente el izado celular por centrifugación y transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un tubo nuevo. A continuación, equilibre 300 microlitros de cuentas de IgG Sepharose con tres re-suspensiones en tampón de purificación antes de agregar las perlas al izado celular despejado para una incubación de dos horas con rotación a cuatro grados Celsius. Al final de la incubación, agregue las cuentas a una columna de cromatografía de 10 mililitros y permita que el izado sin enlazar fluya a través.
Lave las cuentas 10 veces con un mililitro de tampón de lavado por lavado, lo que permite que cada lavado fluya completamente antes de agregar el siguiente volumen. Después del último lavado, utilice una pipeta y un tampón fresco para transferir las perlas a un tubo de microcentrífuga. Llevar el volumen total de las cuentas a 500 microlitros con tampón de lavado fresco y eliminar las perlas del liso con dos microlitros de 10 miligramos por mililitro TEV proteasa para una incubación durante la noche con rotación a cuatro grados Celsius.
A la mañana siguiente, utilice una aguja de calibre 27 para extraer completamente el sobrenadante y evaluar la pureza de la proteína en una página SDS de poliacrilamida 10%. A continuación, cuantifique las proteínas concentradas utilizando el ensayo de proteína Bradford de acuerdo con los protocolos estándar y almacene la proteína hasta una semana a cuatro grados centígrados. Para preparar los liposomas, utilice jeringas de vidrio para transferir lípidos en stock a un tubo de cultivo de vidrio limpio para lograr una mezcla final de lípidos de 1%fosfatidilinositol-3-fosfato, 20%ergosterol, 30%fosfatidilserina, fosfatidilcolina como se describe en la tabla.
Dependiendo de los disolventes en los que se resuspende cada lípido, la mezcla puede volverse turbia al adición de cada lípido. Seque cuidadosamente las mezclas de lípidos dirigiendo el gas nitrógeno de bajo flujo a las mezclas en un movimiento circular para tratar los lípidos uniformemente en la parte inferior del tubo de vidrio. A continuación, envuelva el tubo de cultivo de vidrio con papel de aluminio dejando la abertura descubierta y deshidratar aún más los lípidos en un vacío durante una hora.
Al final de la incubación, añadir 400 microlitros de tampón de unión a cada vial para rehidratar completamente los lípidos a una concentración liposoma final de 2,5 milimolares antes de resuspending los lípidos a velocidad media en un vórtice a temperatura ambiente durante 30 minutos. El búfer debe nublarse a medida que se resuspenden los lípidos. Transfiera los liposomas resuspendidos a un tubo de microcentrífuga y congele los tubos en nitrógeno líquido seguido de descongelación en un baño de agua Celsius de 37 grados de siete a ocho veces.
En una campana de humo química, limpie dos jeringas de vidrio de un mililitro con un volumen completo de cloroformo tres veces por jeringa para eliminar los lípidos residuales y equilibre cada jeringa con dos volúmenes de agua ultrapura y dos volúmenes de tampón de unión. Montar un mini-extrusor de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. A continuación, sumerja dos piezas de soporte de filtro en una membrana de 200 nanómetros en el tampón de unión.
Es importante montar el mini-extrusor para que sea completamente hermético. Y una buena manera de comprobar si hay fugas es pasar el búfer a través del dispositivo. Sandwichar la membrana entre los soportes del filtro y colocar la membrana en el mini-extrusor.
Usando una de las jeringas equilibradas de un mililitro, pase un volumen de tampón de unión similar al volumen de la mezcla liposoma a través del mini-extrusor y utilice la otra jeringa para dejar caer la mezcla liposoma invirtiendo el tubo de microcentrífuga para recoger el último de los liposomas en la tapa del tubo para su recolección. A continuación, extruya los liposomas a través de la membrana de 200 nanómetros de 19 a 21 veces y recoja los liposomas extruidos en un nuevo tubo de microcentrífuga. Antes de realizar los ensayos de unión y tubulación de liposomas SNX-BAR, pre-limpiar la proteína purificada por ultracentrifugación y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga sin alterar el pellet.
A continuación, incubar cuatro micromolares de SNX4-ATG20 purificados y 2,5 milivolares de liposomas en un volumen de reacción total de 20 microlitros para una incubación de 30 minutos a 30 grados centígrados. Para visualizar y cuantificar la tubulación liposoma, al final de la incubación, detecte inmediatamente las muestras en una rejilla de malla de cobre recubierta de carbono y la mancha negativa con 1%acetato de uranilo. A continuación, analice las muestras en un microscopio electrónico de transmisión a 200 kilovoltas.
Para la unión y sedimentación de liposomas, transfiera 20 microlitros de la reacción a un tubo centrífugo de policarbonato y gire la muestra con un router compatible en una ultracentrífuga. Al final de la centrifugación, transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga y resusppend el pellet en 40 microlitros del tampón de muestra de página SDS. Transfiera la suspensión de pellets a un nuevo tubo de microcentrífuga y añada 20 microlitros de tampón de muestra al sobrenadante.
A continuación, cargue volúmenes de muestra equivalentes de pellets y sobrenadantes en un gel de página SDS de 10% poliacrilamida y realice la tinción de Coomassie para visualizar los SNX-BAR unidos a los liposomas. Para comprobar la inducción adecuada de la expresión SNX-BAR, se puede utilizar una mancha occidental contra la etiqueta de purificación de afinidad en tándem, ya que los niveles de proteína de los SNX-BAR pueden no ser detectados a través de la mancha de Coomassie. Después de la purificación del heterodista SNX-BAR, las bandas de los dos SNX-BAR deben aparecer en una relación estequiométrica uno a uno y debe haber poca o ninguna banda contaminante.
En este análisis representativo, los heterodémeros SNX-BAR fueron expresados, purificados y unidos a liposomas sintéticos como se demostró. Tenga en cuenta que MVP1 formó homodómeros y se expresó en bacterias como se esperaba. La unión SNX-BAR a diferentes composiciones de liposomas podría cuantificarse por densitometría para evaluar los efectos de la fosfatidilserina, por ejemplo, en la unión de liposomas.
La microscopía electrónica permite la medición de los túbulos liposomas SNX4-ATG20 con la mayoría de los túbulos que normalmente poseen diámetros entre 14 y 26 nanómetros. Tenga en cuenta que los SNX-VAR purificados se pueden reconstituir con complejos de captura de carga en liposomas para entender cómo los ensamblajes completos pueden influir en la remodelación de la membrana. Al comparar la unión de diferentes combinaciones de dimers SNX-BAR purificados con liposomas sintéticos compuestos de diferentes lípidos, se encontró que las proteínas SNX-BAR poseen preferencias de unión a lípidos distintas.
Trabaje siempre en una capucha cuando manipule cloroformo y asegúrese de usar el EPP adecuado cuando manipule objetos punzantes o materiales de vidrio.
