Este protocolo permite el estudio del cáncer de páncreas en el sitio del tejido nativo, minimizando la inflamación durante la inyección de células tumorales y proporciona un método de alto rendimiento para generar grandes cohortes de ratones. Mediante el uso de la guía por ultrasonido, se elimina la necesidad de cirugía abdominal. En nuestras manos, UG-OTIM tiene una tasa mucho menor de siembra de pared peritoneal en comparación con la implantación ortotópica tradicional.
UG-OTIM produce tumores que recapitulan características histológicas e inmunobiológicas características del microambiente del tumor pancreático y, por lo tanto, se pueden utilizar para investigar nuevas combinaciones terapéuticas en un entorno clínicamente relevante. Desarrollamos este protocolo para terapias de inmunooncología y biología oncológica, pero podría ser utilizado en otras áreas de investigación, incluyendo investigaciones de la función pancreática normal o estados de enfermedad como la diabetes. La imagen por ultrasonido en tiempo real de la inserción e inyección de la aguja es una parte integral de este método.
Por lo tanto, la demostración visual del paso es fundamental para la técnica adecuada. Antes de comenzar el procedimiento, suspendemos la línea de interés de la célula del adenocarcinoma dúctil pancreático en un volumen adecuado de PBS estéril y frío sobre hielo. Coloque las jaulas en una placa de calentamiento celsius de 37 grados, y limpie a fondo el gabinete de seguridad biológica, la cámara de inducción y la etapa de ultrasonido con un esterilizante adecuado.
Establezca la función de calentamiento de la etapa de ultrasonido en 37 grados Celsius y después de la inducción de la anestesia, aplique un ung ón en los ojos del primer animal. Coloque el ratón en la reclinación dorsal en la etapa de ultrasonido, y asegure suavemente las extremidades superior e inferior al escenario con cinta adhesiva. Usa un aplicador de punta de algodón estéril para aplicar una generosa capa de crema depilatoria en el cuadrante superior izquierdo del abdomen sobre la región del bazo hasta la línea media.
Después de un minuto, usa una gasa seca para eliminar suavemente el cabello antes de eliminar el exceso de crema depilatoria con una gasa húmeda salina. A continuación, coloque el ratón en una de las nuevas jaulas limpias en el calentador. Para la implantación de células tumorales guiadas por ultrasonido, ajuste la plataforma de ultrasonido de modo que la superficie sea paralela al suelo, y párese al lado izquierdo del animal con la cabeza del ratón hacia la derecha.
Ajuste la posición del transductor de modo que se obtenga una imagen abdominal transversal y fije las extremidades del ratón a la plataforma con cinta adhesiva. Baje suavemente el transductor para que entre en contacto con el abdomen del ratón y ajuste el transductor hasta que el páncreas sea claramente visible. Localice el riñón izquierdo y el bazo para proporcionar una orientación precisa en la cavidad abdominal.
Cuando se haya localizado el lugar de inyección, cargue una jeringa de insulina de 29 gages y 1/2 pulgada con 25 micro litros de la suspensión de la célula tumoral y limpie la punta de la aguja con una almohadilla de preparación de alcohol estéril. Utilice fórceps de borde romo para agarrar la piel del ratón y la pared peritoneal para aumentar la tensión en el lugar de inyección. Sosteniendo la jeringa en un ángulo de aproximadamente 25 a 45 grados a la superficie de la plataforma de ultrasonido, avance lentamente la aguja a través de la piel y la pared peritoneal.
Confirme que la aguja se ha perforado a través de la pared peritoneal antes de utilizar la visualización por ultrasonido para guiar la aguja directamente hacia el páncreas. Cuando la aguja esté en su lugar, inyecte lentamente las células tumorales. La formación de un bolo líquido dentro del páncreas será evidente en un páncreas correctamente inyectado por ultrasonido.
Una vez que se ha inyectado todo el volumen de la suspensión, y el bolo líquido se puede observar por ultrasonido, mantenga la jeringa muy quieta durante varios segundos antes de retraer lentamente la aguja del abdomen del ratón, teniendo cuidado de no molestar a las células inyectadas. A continuación, coloque el ratón en una jaula nueva y limpia en el calentador con monitoreo hasta la recuperación completa. La colocación adecuada de la aguja en el páncreas, incluida la profundidad y el ángulo de la aguja, es un paso crítico en este protocolo.
La visualización del bolo líquido ayuda a confirmar una inyección de tumor exitosa. Controlar la profundidad de la inyección es el aspecto más difícil. Mi consejo es practicar con inyecciones de tripamboo y confirmar el bolo líquido por ultrasonido y necropsia.
El monitoreo de la implantación tumoral y la tasa de crecimiento por ultrasonido semanal revela tumores que están contenidos dentro de los bordes del páncreas durante todo el período experimental. Las inyecciones de tumores de título alto dan como resultado una mayor proporción de animales con rodamientos de tumores tres semanas después de la inyección en comparación con la cohorte de título bajo. A pesar del retraso en la aparición del tumor, la tasa general de crecimiento tumoral no es significativamente diferente entre las dos dosis.
Del mismo modo, si bien la tasa de supervivencia entre las dos cohortes no es significativamente diferente, tienden a tender a mejorar ligeramente la supervivencia en la cohorte de títulos bajos. La cohorte de títulos altos también produce una mayor proporción de ratones con tumores que son inrollables en estudios preclínicos, por cuatro semanas después de la inyección. Tras el sacrificio, la anatomía bruta de los tumores del modelo de implantación de tumores ortotópicos guiados por ultrasonido es similar a la de los tumores espontáneos de KPC y el análisis histológico demuestra un patrón de estructuras ductales anormales que es similar en ambos modelos y que recapitula la morfología de la enfermedad humana.
En ambos modelos, los tumores están mal infiltrados por las células T, pero altamente infiltrados por los macrófagos. Recuerde sujetar la jeringa en el ángulo adecuado para permitir una entrada suave en el páncreas y para confirmar que la aguja está en el páncreas antes de continuar con la inyección. El crecimiento tumoral se puede controlar y los tumores se pueden cosechar para su análisis por citometría o inmunohistoquímica para determinar el impacto de una intervención.
