Этот протокол позволяет изучать рак поджелудочной железы в родном месте ткани, при минимизации воспаления во время инъекций опухолевых клеток и обеспечивает высокую пропускную способность метода для генерации больших когорт мышей. С помощью ультразвукового руководства, необходимость операции на брюшной полости устраняется. В наших руках, UG-OTIM имеет гораздо более низкий уровень посева брюшной стенки по сравнению с традиционной ортопедической имплантации.
UG-OTIM производит опухоли, которые резюмируют гистологические и иммунобиологические особенности, характерные для микро окружающей среды опухоли поджелудочной железы и поэтому могут быть использованы для исследования новых терапевтических комбинаций в клинически значимых условиях. Мы разработали этот протокол для иммуноонкологии и лечения биологии рака, но он может быть использован в других областях исследований, в том числе исследования нормальной функции поджелудочной железы или заболеваний, таких как диабет. Ультразвуковая визуализация и инъекций иглы в режиме реального времени является неотъемлемой частью этого метода.
Таким образом, визуальная демонстрация шага имеет решающее значение для правильной техники. Перед началом процедуры мы приостанавливаем линию клеток аденокарциномы поджелудочной железы, представляющих интерес для соответствующего объема стерильных, холодных PBS на льду. Поместите клетки на 37 градусов по Цельсию нагревая пластины, и тщательно очистить биологический шкаф безопасности, индукционной камеры и ультразвуковой стадии с соответствующим стерильным.
Установите функцию нагрева ультразвуковой стадии до 37 градусов по Цельсию и после индукции анестезии нанесите мазь на глаза первого животного. Поместите мышь в спинной лежачих на ультразвуковой стадии, и осторожно обеспечить верхние и нижние конечности на сцену с лентой. Используйте стерильный хлопчатобумажный наконечник аппликатора, чтобы применить щедрый слой крема для депилятора в верхнем левом квадранте живота над областью селезенки к средней линии.
Через минуту используйте сухую марлевую площадку, чтобы аккуратно удалить волосы перед удалением избыточного крема для депиляния с солевой влажной марлей. Затем поместите мышь в одну из новых, чистых клеток на теплее. Для ультразвуковой имплантации опухолевых клеток отрегулируйте ультразвуковую платформу так, чтобы поверхность была параллельно полу, и встаньте на левую сторону животного с головой мыши лицом к правой.
Отрегулируйте положение преобразоваваемого так, чтобы получено поперечное изображение брюшной полости, и закретите конечности мыши к платформе лентой. Аккуратно опустите предуц, чтобы связаться с брюшной полостью мыши и настроить предуцера до тех пор, пока поджелудочная железа хорошо видна. Найдите левую почку и селезенку, чтобы обеспечить точную ориентацию в брюшной полости.
Когда место инъекции было расположено, загрузите 29 gage 1/2 дюймовый инсулин шприц с 25 микро-литров подвески опухолевых клеток, и протрите кончик иглы с стерильным алкоголем prep pad. Используйте тупые миппы края, чтобы схватить кожу мыши и перитонеаную стену, чтобы увеличить напряжение в месте инъекции. Удерживая шприц под углом от 25 до 45 градусов к поверхности ультразвуковой платформы, медленно протекуте иглу через кожу и брюхоумную стенку.
Подтвердите, что игла проткнулась через брюшины перед использованием ультразвуковой визуализации, чтобы направлять иглу непосредственно в поджелудочную железу. Когда игла на месте, медленно вводить опухолевые клетки. Формирование жидкого болуса в поджелудочной железе будет очевидно в правильно введенной поджелудочной железе с помощью ультразвука.
После того, как полный объем суспензии был введен, и жидкость болюс можно наблюдать с помощью ультразвука, держать шприц очень еще в течение нескольких секунд, прежде чем медленно втягивания иглы из брюшной полости мыши, заботясь, чтобы не беспокоить вводили клетки. Затем поместите мышь в новую, чистую клетку на теплее с мониторингом до полного выздоровления. Правильное размещение иглы в поджелудочной железе, в том числе глубина иглы и угол является важным шагом в этом протоколе.
Визуализация жидкости болюс помогает подтвердить успешную инъекцию опухоли. Контроль глубины инъекций является наиболее сложным аспектом. Мой совет заключается в практике с трипамбо инъекций и подтвердить жидкости болюс как ультразвук и некропсии.
Мониторинг имплантации опухоли и темпов роста с помощью еженедельной ультразвуковой визуализации выявляет опухоли, которые содержатся в границах поджелудочной железы на протяжении всего экспериментального периода. Высокие инъекции опухоли titer приводят к более высокой доле опухолевых подшипников животных через три недели после инъекции по сравнению с низкой когортой titer. Несмотря на задержку в начале опухоли, общий темп роста опухоли не существенно отличается между двумя дозами.
Аналогичным образом, в то время как выживаемость между двумя когортами существенно не отличается, они, как правило, тенденция к несколько улучшилось выживание в низкой когорте titer. Высокий titer когорты также производит большую долю мышей с опухолями, которые inrollable в доклинических исследованиях, на четыре недели после инъекции. После жертвоприношения, валовой анатомии ультразвука руководствоваться ортопедической опухоли имплантации модели опухолей похож на спонтанные опухоли КЗК и гистологический анализ демонстрирует картину аномальных протоковых структур, которые аналогичны в обеих моделях и что резюмирует морфологии болезни человека.
В обеих моделях опухоли плохо проникают в Т-клетки, но сильно проникают в макрофаги. Не забудьте провести шприц под соответствующим углом, чтобы позволить плавный вход в поджелудочной железе, и подтвердить, что игла в поджелудочной железе, прежде чем приступить к инъекции. Рост опухоли можно контролировать и опухоли могут быть собраны для анализа pho цитометрии или иммуногистохимии, чтобы определить влияние вмешательства.
