このプロトコルは、腫瘍細胞注射中の炎症を最小限に抑えながら、ネイティブ組織部位における膵臓癌の研究を可能にし、マウスの大きなコホートを生成するための高スループット方法を提供する。超音波指導を用いることで、腹部手術の必要性が排除される。私たちの手では、UG-OTIMは、従来の直交性移植と比較して腹膜壁播種の速度がはるかに低い。
UG-OTIMは、膵腫瘍微小環境に特徴的な組織学的および免疫生物学的特徴を再現する腫瘍を産生し、したがって臨床的に関連する環境における新しい治療組み合わせを調査するために使用することができる。免疫腫瘍学やがん生物学の治療用にこのプロトコルを開発しましたが、正常な膵臓機能や糖尿病などの疾患状態の調査を含む他の研究分野で使用することができます。針の挿入および注入の実時間超音波のイメージ投射はこの方法の不可欠な部分である。
したがって、ステップの視覚的なデモンストレーションは、適切なテクニックのために重要です。処置を開始する前に、我々は氷上の滅菌、冷たいPBSの適切な量の関心の膵管内腺癌細胞株を中断する。37°Cの加温プレートにケージを置き、適切な滅菌剤で生物学的安全キャビネット、誘導室および超音波ステージを徹底的に清掃します。
超音波ステージの温暖化機能を摂氏37度に設定し、麻酔の誘導後、最初の動物の目に軟膏を適用する。超音波ステージ上の底面の不用さにマウスを置き、テープでステージに上端と下肢を静かに固定します。無菌綿の先端アプリケーターを使用して、脾臓の領域を介して腹部の左上象限に脱毛クリームの寛大な層を正中線に適用します。
1分後、乾燥ガーゼパッドを使用して髪を静かに取り除き、生理食いぬれたガーゼで余分な脱毛クリームを取り除きます。その後、暖かい上に新しい、きれいなケージの一つにマウスを置きます。超音波誘導腫瘍細胞移植の場合、表面が床に平行になるように超音波プラットフォームを調整し、マウスの頭部を右に向けて動物の左側に立ちます。
横方向の腹部画像が得られるようにトランスデューサの位置を調整し、テープでマウスの手足をプラットフォームに固定します。トランスデューサを穏やかに下げてマウスの腹部に接触させ、膵臓がはっきりと見えるまでトランスデューサを調整します。左腎臓と脾臓を見つけて、腹腔内の正確な向きを提供します。
注射部位が見つかったら、29ゲージの1/2インチのインスリン注射器を25マイクロリットルの腫瘍細胞懸濁液でロードし、無菌アルコール準備パッドで針先を拭く。鈍いエッジ鉗子を使用してマウスの皮膚と腹壁をつかみ、注射部位の緊張を高めます。注射器を超音波プラットフォーム表面に対して約25〜45度の角度で保持し、ゆっくりと皮膚と腹壁を通して針を進める。
超音波の可視化を利用して針を膵臓に直接導く前に、針が腹膜壁を通って穿刺されたことを確認してください。針が所定の位置にある場合は、ゆっくりと腫瘍細胞を注入する。膵臓内の流体ボーラスの形成は、超音波によって正しく注入された膵臓で明らかである。
懸濁液の全容が注入され、流体ボーラスが超音波で観察されると、注射器を数秒間静かに保持してから、ゆっくりとマウス腹部から針を引き込み、注射された細胞を邪魔しないように注意する。その後、完全な回復まで監視とウォーマーの新しい、きれいなケージにマウスを置きます。膵臓の適切な針の配置, 針の深さと角度を含むこのプロトコルの重要なステップ.
流体ボーラスの可視化は、腫瘍注入の成功を確認するのに役立ちます。注射の深さを制御することは最も困難な側面です。私のアドバイスは、トリアンブー注射で練習し、超音波と壊死の両方によって流体ボーラスを確認することです。
週に1回の超音波画像による腫瘍移植と増殖速度のモニタリングは、実験期間全体を通して膵臓の境界内に含まれる腫瘍を明らかにする。高力価腫瘍注射は、低力価コホートと比較して、注射の3週間後に腫瘍を持つ動物の割合が高くなります。腫瘍の発症の遅れにもかかわらず、全体的な腫瘍の増殖速度は、2つの用量間で有意に異なっていない。
同様に、2つのコホート間の生存率は有意に異なっていないが、それらは低力価コホートでわずかに改善された生存に向かう傾向がある。高い対値コホートはまた、注射後4週間までに、前臨床試験で不安定である腫瘍を有するマウスのより大きな割合を産生する。犠牲の際、超音波誘導異形性腫瘍移植モデル腫瘍の総解剖学は、自発的なKPC腫瘍のそれと同様であり、組織学的分析は、両方のモデルで類似し、ヒト疾患の形態を再現する異常な管構造のパターンを示す。
どちらのモデルでも、腫瘍はT細胞に浸透していないが、マクロファージによって非常に浸透している。注射器を適切な角度で保持して膵臓に滑らかに入り込み、注射を進める前に針が膵臓に入っていることを確認してください。腫瘍の成長を監視し、腫瘍を採取して、細胞組織検査または免疫組織化学による分析を行い、介入の影響を判断することができます。
