Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung von Bauchspeicheldrüsenkrebs in der nativen Gewebestelle, während Entzündungen während der Tumorzellinjektion minimiert werden und bietet eine Methode mit hohem Durchsatz zur Erzeugung großer Kohorten von Mäusen. Durch die Verwendung von Ultraschallführung wird die Notwendigkeit einer Bauchoperation eliminiert. In unseren Händen hat UG-OTIM eine viel geringere Rate an peritonealer Wandsaat als herkömmliche orthotopische Implantation.
UG-OTIM produziert Tumore, die histologische und immunbiologische Merkmale rekapitulieren, die für die Mikroumgebung des Bauchspeicheldrüsentumors charakteristisch sind und daher zur Untersuchung neuartiger therapeutischer Kombinationen in einem klinisch relevanten Umfeld verwendet werden können. Wir haben dieses Protokoll für immunonkologische und krebsbiologische Therapien entwickelt, aber es könnte in anderen Forschungsbereichen verwendet werden, einschließlich Untersuchungen der normalen Bauchspeicheldrüsenfunktion oder Krankheitszuständen wie Diabetes. Die Echtzeit-Ultraschall-Bildgebung der Nadeleinfügung und -injektion ist ein integraler Bestandteil dieser Methode.
Daher ist die visuelle Demonstration des Schritts entscheidend für die richtige Technik. Bevor wir mit dem Eingriff beginnen, setzen wir die pankreatische duktile Adenokarzinom-Zelllinie aus, die von Interesse ist, in einem geeigneten Volumen steriler, kalter PBS auf Eis. Legen Sie Käfige auf eine 37 Grad Celsius Wärmeplatte und reinigen Sie den biologischen Sicherheitsschrank, die Induktionskammer und die Ultraschallstufe gründlich mit einem geeigneten Sterilmittel.
Stellen Sie die Erwärmungsfunktion des Ultraschallstadiums auf 37 Grad Celsius und nach der Induktion der Anästhesie, Tragen Sie Salbe auf die Augen des ersten Tieres auf. Legen Sie die Maus in dorsaler Rekonntonie auf die Ultraschallstufe und sichern Sie die oberen und unteren Extremitäten vorsichtig mit Klebeband auf die Bühne. Verwenden Sie einen sterilen Baumwollspitzen-Applikator, um eine großzügige Schicht Enthaarungscreme auf den oberen linken Quadranten des Bauches über den Bereich der Milz bis zur Mittellinie aufzutragen.
Nach einer Minute, verwenden Sie ein trockenes Gazepad, um das Haar sanft zu entfernen, bevor Sie die überschüssige Enthaarungscreme mit einer saline nassen Gaze entfernen. Dann legen Sie die Maus in einen der neuen, sauberen Käfige auf dem wärmeren. Passen Sie bei der Ultraschall-geführten Tumorzellimplantation die Ultraschallplattform so an, dass die Oberfläche parallel zum Boden verläuft, und stehen Sie auf der linken Seite des Tieres mit dem Kopf der Maus nach rechts.
Stellen Sie die Wandlerposition so ein, dass ein queres Bauchbild erhalten ist, und sichern Sie die Gliedmaßen der Maus mit Klebeband an der Plattform. Senken Sie den Messumformer vorsichtig, um den Mausbauch zu berühren, und stellen Sie den Messumformer so lange ein, bis die Bauchspeicheldrüse deutlich sichtbar ist. Suchen Sie die linke Niere und Milz, um eine genaue Orientierung in der Bauchhöhle zu bieten.
Wenn die Injektionsstelle gefunden wurde, laden Sie eine 29 gage 1/2 Zoll Insulinspritze mit 25 Mikroliter der Tumorzellsuspension, und wischen Sie die Nadelspitze mit einem sterilen Alkohol-Prep-Pad ab. Verwenden Sie stumpfe Kantenzange, um die Maushaut und die Peritonealwand zu erfassen, um die Spannung an der Injektionsstelle zu erhöhen. Halten Sie die Spritze in einem Etwa 25 bis 45 Grad Winkel zur Oberfläche der Ultraschallplattform, bringen Sie die Nadel langsam durch die Haut und die Peritonealwand.
Bestätigen Sie, dass die Nadel durch die Peritonealwand durchbohrt wurde, bevor Sie die Ultraschallvisualisierung verwenden, um die Nadel direkt in die Bauchspeicheldrüse zu führen. Wenn die Nadel an Ort und Stelle ist, injizieren Sie langsam die Tumorzellen. Die Bildung eines flüssigen Bolus in der Bauchspeicheldrüse wird in einer korrekt injizierten Bauchspeicheldrüse durch Ultraschall sichtbar sein.
Sobald das volle Volumen der Suspension injiziert wurde, und die Flüssigkeit Bolus durch Ultraschall beobachtet werden kann, halten Sie die Spritze sehr still für einige Sekunden, bevor Sie langsam die Nadel aus dem Mausbauch zurückziehen, wobei darauf geachtet wird, die injizierten Zellen nicht zu stören. Legen Sie die Maus dann in einen neuen, sauberen Käfig auf dem Wärmer mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung. Die richtige Nadelplatzierung in der Bauchspeicheldrüse, einschließlich Nadeltiefe und Winkel, ist ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll.
Die Visualisierung des Flüssigbolus hilft, eine erfolgreiche Tumorinjektion zu bestätigen. Die Kontrolle der Injektionstiefe ist der schwierigste Aspekt. Mein Rat ist, mit Tripamboo-Injektionen zu üben und Flüssigkeitsbolus durch Ultraschall und Nekropsie zu bestätigen.
Die Überwachung der Tumorimplantation und Wachstumsrate durch wöchentliche Ultraschall-Bildgebung zeigt Tumore, die innerhalb der Grenzen der Bauchspeicheldrüse während des gesamten Versuchszeitraums enthalten sind. Hohe Titertumor-Injektionen führen drei Wochen nach der Injektion zu einem höheren Anteil an tumortragenden Tieren als die Low Titer Kohorte. Trotz der Verzögerung beim Tumorbeginn unterscheidet sich die Gesamttumorwachstumsrate zwischen den beiden Dosen nicht signifikant.
In ähnlicher Weise, während die Überlebensrate zwischen den beiden Kohorten nicht signifikant unterschiedlich ist, neigen sie dazu, zu einem leicht verbesserten Überleben in der Low Titer Kohorte zu tendieren. Die High Titer Kohorte produziert auch einen größeren Anteil von Mäusen mit Tumoren, die in präklinischen Studien inrollbar sind, durch vier Wochen nach der Injektion. Nach dem Opfer ist die grobe Anatomie von ultraschallgeführten orthotopischen Tumorimplantationsmodelltumoren ähnlich wie bei spontanen KPC-Tumoren und die histologische Analyse zeigt ein Muster abnormer duktaler Strukturen, das in beiden Modellen ähnlich ist und die Morphologie der menschlichen Krankheit rekapituliert.
In beiden Modellen werden die Tumoren schlecht von T-Zellen infiltriert, aber stark durch Makrophagen infiltriert. Denken Sie daran, die Spritze in dem entsprechenden Winkel zu halten, um einen reibungslosen Eintritt in die Bauchspeicheldrüse zu ermöglichen, und zu bestätigen, dass die Nadel in der Bauchspeicheldrüse ist, bevor Sie mit der Injektion fortfahren. Das Tumorwachstum kann überwacht und Tumoren zur Analyse durch Phozytometrie oder Immunhistochemie geerntet werden, um die Auswirkungen einer Intervention zu bestimmen.
