이 프로토콜은 종양 세포 주입 도중 염증을 최소화하고 마우스의 큰 코호트를 생성하는 높은 처리량 방법을 제공하면서, 네이티브 조직 사이트에 있는 췌장암의 연구 결과를 허용합니다. 초음파 지도를 사용하여 복부 수술의 필요성이 제거됩니다. 우리의 손에, UG-OTIM는 전통적인 직교 이식에 비해 하각 벽 파종의 훨씬 낮은 비율을 가지고.
UG-OTIM은 췌장 종양 마이크로 환경의 특징을 재구성하고 임상적으로 관련된 환경에서 새로운 치료 조합을 조사하는 데 사용할 수 있는 종양을 생성합니다. 우리는 면역 종양학 과 암 생물학 치료를 위한 이 프로토콜을 개발했습니다, 그러나 당뇨병과 같은 일반적인 췌장 기능 또는 질병 상태의 조사를 포함하여 그밖 연구 지역에 이용될 수 있었습니다. 바늘 삽입 및 주입의 실시간 초음파 이미징은이 방법의 필수적인 부분입니다.
따라서 단계의 시각적 데모는 적절한 기술에 매우 중요합니다. 절차를 시작하기 전에, 우리는 얼음에 멸균, 차가운 PBS의 적당한 양에 관심있는 췌장 연성 adenocarcinoma 세포주를 중단합니다. 케이지를 섭씨 37도 의 온난화 플레이트에 놓고 생물학적 안전 캐비닛, 유도 챔버 및 초음파 스테이지를 적절한 멸균제로 철저히 청소하십시오.
초음파 단계의 온난화 기능을 섭씨 37도로 설정하고 마취를 유도 한 후 첫 번째 동물의 눈에 연고를 적용하십시오. 마우스를 초음파 스테이지에 등쪽 의 반소에 놓고 테이프로 무대까지 상하 의 사지를 부드럽게 고정시하십시오. 멸균 면 팁 어플리케이터를 사용하여 비장 부위를 중간선에 걸쳐 복부의 왼쪽 상단 사분면에 넉넉한 분모 크림층을 가드하십시오.
1 분 후, 식염수 젖은 거즈와 여분의 탈모 크림을 제거하기 전에 부드럽게 머리를 제거하기 위해 마른 거즈 패드를 사용합니다. 그런 다음 마우스를 따뜻하고 깨끗한 새장 중 하나에 놓습니다. 초음파 유도 종양 세포 이식의 경우 초음파 플랫폼을 조정하여 표면이 바닥과 평행하도록 하고 마우스의 머리가 오른쪽으로 향하도록 동물의 왼쪽에 서십시오.
횡복부 영상을 얻을 수 있도록 트랜스듀서 위치를 조정하고 테이프로 마우스 팔다리를 플랫폼에 고정시한다. 트랜스듀서를 부드럽게 낮추어 마우스 복부에 접촉하고 췌장이 명확하게 보일 때까지 트랜스듀서를 조정합니다. 왼쪽 신장과 비장을 찾아 복강에서 정확한 방향을 제공합니다.
주사 부위가 있는 경우 종양 세포 현탁액의 25 마이크로 리터로 29 gage 1/2 인치 인슐린 주사기를 적재하고 멸균 알코올 준비 패드로 바늘 끝을 닦아냅니다. 무딘 가장자리 집게를 사용하여 마우스 피부와 수막 벽을 파악하여 주사 부위의 장력을 높입니다. 주사기를 초음파 플랫폼 표면에 약 25~45도 각도로 잡고 피부와 회중 벽을 통해 바늘을 천천히 전진시다.
바늘이 췌장으로 직접 바늘을 안내초음파 시각화를 활용하기 전에 관상 벽을 통해 구멍을 뚫은 것을 확인하십시오. 바늘이 제자리에 있을 때, 천천히 종양 세포를 주입하십시오. 췌장 내의 유체 볼루스의 형성은 초음파에 의해 올바르게 주입 된 췌장에서 분명할 것입니다.
일단 현탁액의 전체 부피가 주입되고, 액체 bolus는 초음파에 의해 관찰 될 수 있습니다, 천천히 마우스 복부에서 바늘을 철회하기 전에 몇 초 동안 주사기를 매우 여전히 잡고, 주입 된 세포를 방해하지 않도록주의. 그런 다음 마우스를 완전히 복구 할 때까지 모니터링하여 따뜻한 곳에 새롭고 깨끗한 케이지에 넣습니다. 바늘 깊이와 각도를 포함하여 췌장에 적절한 바늘 배치는이 프로토콜에서 중요한 단계입니다.
유체 볼루스의 시각화는 성공적인 종양 주사를 확인하는 데 도움이됩니다. 주입의 깊이를 제어하는 것은 가장 어려운 측면이다. 내 조언은 tripamboo 주사와 함께 연습하 고 초음파와 부검 모두에 의해 액체 bolus를 확인 하는 것입니다.
주간 초음파 화상 진찰에 의하여 종양 이식 및 성장 속도의 감시는 전체 실험 기간 내내 췌장의 경계 안에 포함된 종양을 제시합니다. 높은 티터 종양 주사는 낮은 티터 코호트에 비해 주사 후 3 주 동안 종양 베어링 동물의 높은 비율을 초래한다. 종양 발병의 지연에도 불구하고, 전반적인 종양 성장 속도는 두 복용량 사이 유의하로 다르지 않습니다.
유사하게, 두 집단 사이의 생존율은 크게 다르지 않지만, 그들은 낮은 티터 코호트에서 약간 향상된 생존을 향해 추세하는 경향이있다. 높은 티터 코호트는 또한 전임상 연구에서 굴릴 수 없는 종양을 가진 마우스의 더 큰 비율을 생성합니다, 4 주 후 주입에 의하여. 희생시, 초음파 유도 직교 종양 이식 모델 종양의 총 해부학은 자발적인 KPC 종양및 조직학적 분석의 종양과 유사하며 두 모델 모두에서 유사한 비정상적인 덕트 구조의 패턴을 나타내며 인간 질환의 형태를 재구성합니다.
두 모델에서 종양은 T 세포에 의해 제대로 침투하지 만 대식세포에 의해 매우 침투합니다. 췌장에 원활한 입력을 허용 하기 위해 적절 한 각도에서 주사기를 보유 하는 것을 기억, 주사를 진행 하기 전에 췌장에 바늘의 확인. 종양 성장은 모니터링될 수 있고 종양은 내정간섭의 충격을 결정하기 위하여 pho 세포질 또는 면역작용화학에 의하여 분석을 위해 수확될 수 있다.
