Aunque la angioplastia ayuda a los pacientes con enfermedad de las arterias coronarias, los eventos cardiovasculares todavía pueden ocurrir después del procedimiento. Como los MPC y las moléculas solubles se obtienen de la circulación coronaria, pueden estar correlacionados con el grado de daño vascular y reparación. Por lo tanto, el MPC coronario y los niveles de mediador soluble se pueden utilizar para estimar eventos cardiovasculares y pronóstico en pacientes con enfermedad de las arterias coronarias sometidos a angioplastia coronaria.
Los MPC y las moléculas solubles también se pueden utilizar para estimar las complicaciones y pronósticos que se producen en diferentes entornos isquémicos, como el accidente cerebrovascular isquemio de las extremidades recurrentes. Demostrando el procedimiento serán Eduardo Vera-Gomez y Alejandro Hernández-Patricio, técnicos de laboratorio, y Karen De La Vega-Moreno y Carlos Zamora-Aleman, estudiantes de grado. También se manifestará Gabriela Alexandra Domínguez-Pérez, estudiante de Maestría en Ciencias, Alberto Melchor-López, estudiante de doctorado, y Mario Antonio Tellez-Gonzalez, colaborador de Maestría en Ciencias.
Dentro de una hora de recolección, transfiera seis mililitros de la muestra de sangre cosechada a un tubo cónico de 15 mililitros y diluya la sangre en una proporción de uno a uno en PBS. Agregue dos mililitros de gradiente de densidad medio a tres tubos de ensayo y transfiera cuidadosamente tres alícuotas iguales de sangre diluida a cada tubo de gradiente de densidad medio. Separe las células por centrifugación y transfiera las células en la interfaz a un nuevo tubo.
Lavar las células recogidas una vez en dos mililitros de PBS durante seis minutos, seguidos de seis lavados en dos mililitros de PBS fresco por lavado durante dos minutos. Después del último lavado, vuelva a suspender el pellet celular que contiene MPC en un mililitro de PBS para contar y agregue una por diez a las seis células para etiquetar los tubos de citometría de flujo de cinco mililitros. Pelecila las células por centrifugación y añada 100 microlitros del anticuerpo de interés adecuado, diluidos en solución de incubación de anticuerpos a cada tubo.
Mezcle suavemente las células con cada cóctel de anticuerpos añadido durante 10 segundos, y coloque las muestras a cuatro grados centígrados, protegidos de la luz, durante 20 minutos. Al final de la incubación, centrifugar las muestras y volver a suspender los pellets en 500 microlitros de PBS complementados con dos EDTA milimolares. Usando controles de coincidencia de isotipos para configurar la tinción de fondo, analice las muestras por citometría de flujo de acuerdo con los protocolos estándar, gating en los linfocitos en una gráfica de dispersión hacia adelante por lado, para excluir granulocitos residuales, desechos celulares y otras partículas.
Establezca una puerta para que contenga un alto número de celdas con un fenotipo CD34 positivo en CD45. A continuación, utilice la puerta CD45 positiva CD34-positiva para seleccionar las células cd133 o CD184-positivas del receptor de dominio de inserción de quinasa. Las subpúmeros MPC pueden ser identificadas por sus marcadores de superficie celular específicos y reportadas como el porcentaje de eventos bloqueados.
Para determinar la concentración de biomarcadores solubles en las muestras de sangre recogidas, primero, lave dos veces las placas ELISA pre-recubiertas apropiadas con el tampón de lavado proporcionado por el kit y etiquete los tubos estándar, de muestra y de control. Centrifugar la muestra de sangre para separar los componentes sanguíneos y alicuar el plasma en los tubos de muestra. Transfiera las normas, muestras y controles a los pozos apropiados y selle e incuba la placa a 37 grados centígrados durante 90 minutos.
Al final de la incubación, deseche el contenido del pozo y agregue el anticuerpo de detección de biotina a cada pocóylo. Después de una incubación de una hora a 37 grados Centígrados, deseche el contenido del plato y lave los pozos tres veces con tampón de lavado fresco por lavado. Después del último lavado, incubar las muestras con solución de trabajo de Streptavidin durante 30 minutos a 37 grados centígrados seguidos de tres lavados, como se ha demostrado.
Después del último lavado, tratar las muestras con sustrato de tetrametilbenzidina durante 30 minutos a 37 grados Centígrados. Cuando se desarrolle el color, añada la solución stop del kit y lea la absorción de densidad óptica en un lector ELISA de microplaca. Para determinar la concentración del factor de necrosis tumoral alfa, e interleucina-1 beta, utilizando multiplexación inmunomagnética, etiquete los tubos estándar, de muestra y de control y vórtice los viales de cuentas magnéticas durante 30 segundos.
Agregue perlas a los pozos apropiados de la placa de ensayo de multiplexación. Cuando se hayan añadido todas las perlas, inserte de forma segura la arandela de placa magnética de mano y espere dos minutos para que las perlas se acumulen en la parte inferior de cada pozo, antes de invertir rápidamente tanto la arandela de placa magnética de mano, como el ensamblaje de la placa sobre un contenedor de residuos. A continuación, agregue 150 microlitros de tampón de lavado a cada pozo y espere 30 segundos para permitir que las perlas se acumulen en la parte inferior.
Deseche el contenido de nuevo como se acaba de demostrar y añada 25 microlitros de búfer de ensayo universal y 25 microlitros de las normas, muestras y controles preparados. Selle la placa durante al menos 60 minutos de incubación, protegida de la luz a temperatura ambiente, y 500 rotaciones por minuto. Al final de la incubación, añadir 150 microlitros de tampón de lavado a cada pocóteo y dejar que las cuentas se asienten durante 30 segundos.
A continuación, utilice la arandela de placas para desechar el contenido del pozo y etiquetar cada pozo con 25 microlitros de mezcla de anticuerpos de detección seguidos de dos lavados, como se ha demostrado. Después del segundo lavado, incubar las muestras con 25 microlitros de Streptavidin PE durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, añadir 120 microlitros de tampón de lectura a cada pocillo y sellar la placa para una incubación de cinco minutos, protegida de la luz a temperatura ambiente, para 500 rotaciones por minuto.
A continuación, cargue la placa en un lector de ensayo de multiplexación y ajuste los parámetros de lectura de acuerdo con cada analito. Se recogieron sangre coronaria, venus-sinus y periférica de 52 pacientes que se sometieron a angiografía coronaria y demostraron una alta prevalencia de hipertensión y dislipidemia. La concentración coronaria basal de la mayoría de los CPC fue significativamente menor en pacientes que desarrollaron eventos cardiovasculares adversos importantes, con una mayor disminución de las subpoblaciones MPC CD34 positivas CD133 positivos, y CD45 positivo, CD34 positivo, CD133 positivo, CD184 positivo.
Del mismo modo, los pacientes que desarrollaron eventos cardiovasculares adversos importantes tuvieron un mayor valor basal en cantidades coronarias de ICAM-1 soluble y cantidades más bajas de proteína metallomatrix 9. Los MPC coronarios y el ICAM-1 soluble demostraron una capacidad de pronóstico para una supervivencia importante libre de eventos cardiovasculares adversos. Curiosamente, la expresión del factor de necrosis tumoral alfa demostró variaciones según el tiempo de medición y la ubicación del muestreo coronario basado en una comparación de diferentes áreas de lumen en la misma arteria coronaria, utilizando ultrasonido intravascular.
Durante el aislamiento MPC, asegúrese de transferir la sangre al gradiente de densidad, y recoger las células de la interfaz después de la centrifugación cuidadosamente. El vórtice periódico previene la precipitación del cordón y el uso de una arandela de placa magnética ayuda a mantener las perlas dentro de los pozos durante los lavados. Los CPP coronarios y las moléculas solubles son útiles para estratificar el riesgo de eventos cardiovasculares durante el seguimiento después de la angioplastia, ayudando en la provisión de prevenciones secundarias a individuos de alto riesgo ya que esta técnica refleja el proceso fisiopatológico que se produce durante el cese de la solución, podría ser útil para condiciones en las que la biología vascular juega un papel.
