Anjiyoplasti koroner arter hastalığı olan hastalara yardımcı olsa da, kardiyovasküler olaylar hala işlemden sonra oluşabilir. MpC'ler ve çözünür moleküller koroner dolaşımdan elde edildikçe, vasküler hasar ve onarım derecesi ile ilişkili olabilir. Bu nedenle koroner anjiyoplasti geçiren koroner arter hastalığı olan hastalarda kardiyovasküler olaylar ve prognoz tahmin etmek için koroner MPC ve çözünür mediator düzeyleri kullanılabilir.
MpC'ler ve çözünür moleküller de tekrarlayan ekstremite iskemi inme gibi farklı iskemik ayarları altında meydana gelen komplikasyonları ve prognozları tahmin etmek için kullanılabilir. Prosedürü gösteren Eduardo Vera-Gomez ve Alejandro Hernandez-Patricio, laboratuvar teknisyenleri ve Karen De La Vega-Moreno ve Carlos Zamora-Aleman, lisans öğrencileri olacaktır. Ayrıca Gabriela Alexandra Dominguez-Perez, Bir Master Bilim öğrencisi, Alberto Melchor-Lopez, doktora öğrencisi ve Mario Antonio Tellez-Gonzalez, Bilim işbirlikçi yüksek lisans olacaktır.
Toplama bir saat içinde, 15 mililitre konik tüp için hasat kan örneği altı mililitre transfer ve PBS bir oran bir-bir oranda kan seyreltmek. Üç test tüpüne iki mililitre yoğunluk gradyan orta ekleyin ve her yoğunluk gradyan ortamı tüpüne üç eşit seyreltilmiş kan aktarın. Hücreleri santrifüj le ayırın ve arabirimdeki hücreleri yeni bir tüpe aktarın.
Toplanan hücreleri altı dakika boyunca iki mililitre PBS'de bir kez yıkayın, ardından iki dakika boyunca yıkama başına iki mililitre taze PBS'de altı yıkama. Son yıkamadan sonra, sayma için PBS bir mililitre MPC içeren hücre pelet yeniden askıya ve beş mililitre akış sitometri tüpleri etiketli altı hücrelere bir kez on ekleyin. Santrifüj ile hücreleri pelet ve ilgi uygun antikor 100 mikrolitre ekleyin, her tüp için antikor kuluçka çözeltisi seyreltilmiş.
Hücreleri 10 saniye boyunca eklenen her bir antikor kokteyliyle hafifçe karıştırın ve numuneleri ışıktan korunan dört santigrat dereceye 20 dakika yerleştirin. Kuluçka sonunda, örnekleri santrifüj ve pbs 500 mikrolitre iki milimolar EDTA ile birlikte pelet yeniden askıya. Arka plan boyama kurmak için izotip uyumlu kontrolleri kullanarak, standart protokollere göre akış sitometri tarafından örnekleri analiz, yan dağılım arsa bir ileri lenfositler üzerinde gating, artık granülositler dışlamak için, hücresel enkaz, ve diğer parçacıklar.
CD45-pozitif CD34-pozitif fenotip içeren yüksek sayıda hücre içerecek bir geçit ayarlayın. Daha sonra, kizaz eklemek etki alanı reseptörcd133 veya CD184-pozitif hücreleri seçmek için CD45-pozitif CD34-pozitif kapı kullanın. MPC alt popülasyonları daha sonra kendi özel hücre yüzey idacarı ile tanımlanabilir ve geçitli olayların yüzdesi olarak raporlanabilir.
Toplanan kan örneklerinde çözünür biyobelirteçlerin konsantrasyonunun belirlenmesi için, öncelikle, kit tarafından sağlanan yıkama tamponu ile uygun önceden kaplanmış ELISA plakaları iki kez yıkayın ve standart, numune ve kontrol tüplerini etiketleyin. Kan bileşenlerini ayırmak için kan örneğini santrifüj edin ve plazmayı örnek tüplere aktarın. Standartları, numuneleri ve kontrolleri uygun kuyulara aktarın ve plakayı 90 dakika boyunca 37 derecede mühürleyin ve kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sonunda, iyi içeriğini atın ve her kuyuya biotin algılama antikor ekleyin. 37 santigrat derece bir saat kuluçka sonra, plaka içeriğini atın ve yıkama başına taze yıkama tampon ile kuyuları üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, 37 santigrat derece streptavidin çalışma çözeltisi ile örnekleri kuluçkaya 37 santigrat derece, gösterildiği gibi üç yıkama takip.
Son yıkamadan sonra, 37 santigrat derece tetrametilbenzidin substrat ile 30 dakika boyunca örnekleri tedavi. Renk geliştiğinde, kitten stop çözeltisi ekleyin ve bir mikroplaka ELISA okuyucuda optik yoğunluk emiciliğini okuyun. İmmünmanyetik multiplekskullanarak tümör nekroz faktör alfa ve interlökin-1 beta konsantrasyonu belirlemek için, standart etiket, örnek, ve kontrol tüpleri ve girdap manyetik boncuk şişeleri için 30 saniye.
Çoklama test plakasının uygun kuyularına boncuk ekleyin. Tüm boncuklar eklendiğinde, güvenli bir şekilde el manyetik plaka yıkağı ekleyin ve boncuklar her kuyunun altında birikmesi için iki dakika bekleyin, hızlı bir şekilde hem el manyetik plaka yıkayıcılık ters önce, ve bir atık konteyner üzerinde plaka montaj. Daha sonra, her kuyuya 150 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve boncukların alt tabakada birikmesine izin vermek için 30 saniye bekleyin.
İçeriği, az önce gösterildiği gibi atın ve 25 mikrolitre evrensel test arabelleği ve hazırlanan standartlar, numuneler ve kontrollerden 25 mikrolitre ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında ışıktan korunan en az 60 dakikalık bir kuluçka için ve dakikada 500 dönüş için kapatın. Kuluçka sonunda, her kuyuya 150 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve boncukların 30 saniyeye yerleşmesine izin verin.
Daha sonra, iyi içeriğini atmak ve tespit antikor karışımı 25 mikrolitre ile her iyi etiket için plaka yıkağı kullanın iki yıkama takip, gösterildiği gibi. İkinci yıkamadan sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca Streptavidin PE 25 mikrolitre ile örnekleri kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, her kuyuya 120 mikrolitre okuma tamponu ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında ışıktan korunan beş dakikalık bir kuluçka için dakikada 500 dönüş için kapatın.
Daha sonra plakayı çoklayıcı bir test okuyucusuna yükleyin ve okuma parametrelerini her analize göre ayarlayın. Koroner anjiyografi yapılan 52 hastadan koroner, venüs-sinüs ve periferik kan toplandı ve hipertansiyon ve dislipidemi prevalansı yüksekti. Çoğu MpC'nin temel koroner konsantrasyonu majör advers kardiyovasküler olaylar gelişen hastalarda anlamlı olarak daha düşüktü, MPC alt popülasyonlarında CD34-pozitif CD133-pozitif ve CD45-pozitif, CD34-pozitif, CD133-pozitif, CD184-pozitif.
Aynı şekilde, majör advers kardiyovasküler olaylar gelişen hastalarda çözünür ICAM-1 koroner miktarlarda ve daha düşük miktarda metallomatrix protein 9'da bazal inanCa sahip olundu. Koroner MpC'ler ve çözünür ICAM-1 majör advers kardiyovasküler olaysız sağkalım için prognostik bir yetenek gösterdi. İlginçtir, tümör nekroz faktör alfa ekspresyonu, intravasküler ultrason kullanarak, aynı koroner arterfarklı lümen alanlarının karşılaştırılmasıdayalı ölçüm süresi ve koroner örnekleme konumuna göre varyasyonları gösterdi.
MPC yalıtımı sırasında, kanı yoğunluk gradyan Üzerine aktardıktan ve santrifüjden sonra hücreleri arayüzden dikkatlice topladığınızdan emin olun. Periyodik girdap boncuk yağışı önler ve manyetik bir plaka yıkAma kullanarak yıkar sırasında kuyular içinde boncuk tutmaya yardımcı olur. Koroner MpC'ler ve çözünür moleküller anjiyoplasti sonrası takip sırasında kardiyovasküler olayların riskini tabakalaştırmak için yararlıdır, bu teknik çözeltinin durdurulması sırasında meydana gelen patofizyolojik süreci yansıttığı için yüksek riskli bireylere ikincil önlemelerin sağlanmasına yardımcı olmak, vasküler biyolojinin rol oynadığı durumlar için yararlı olabilir.
