למרות אנגיופלסטיקה מסייעת לחולים עם מחלת לב כלילית, אירועי לב וכלי דם עדיין יכול להתרחש לאחר ההליך. כמו MPCs ומולקולות מסיסים מתקבלים ממחזור הכלילי, הם יכולים להיות בקורלציה עד מידת נזק כלי הדם ותיקון. MPC כלילית ורמות מתווך מסיס ולכן ניתן להשתמש כדי להעריך אירועי לב וכלי דם ופרוגנוזה בחולים עם מחלת לב כלילית עוברים אנגיופלסטיקה כללית.
MPCs ומולקולות מסיסים עשויים לשמש גם כדי להעריך סיבוכים ופרוגנוזה המתרחשים תחת הגדרות איסכמיות שונות, כגון שבץ איסכמי גפיים חוזר. הדגמת ההליך תהיה אדוארדו ורה-גומז ואלחנדרו הרננדז-פטריסיו, טכנאי מעבדה, וקארן דה לה וגה-מורנו וקרלוס זמורה-אלמן, סטודנטים לתואר ראשון. כמו כן יפגינו גבריאלה אלכסנדרה דומינגז-פרז, סטודנטית לתואר שני במדעים, אלברטו מלכיור-לופז, דוקטורנט, ומריו אנטוניו טלס-גונזלס, אמן המדעים.
בתוך שעה אחת של איסוף, להעביר שישה מיליליטר של דגימת הדם שנקטפו לצינור חרוט 15 מיליליטר ולדלל את הדם ביחס של אחד לאחד PBS. מוסיפים שני מיליליטר של צפיפות הדרגתית בינונית לשלוש מבחנות ומעבירים בזהירות שלושה אליקוטים שווים של דם מדולל לכל צינור של מדיום שיפוע צפיפות. להפריד את התאים על ידי צנטריפוגה ולהעביר את התאים בממשק לצינור חדש.
לשטוף את התאים שנאספו פעם אחת בשני מיליליטר של PBS במשך שש דקות, ואחריו שש שטיפות בשני מיליליטר של PBS טרי לכל לשטוף במשך שתי דקות. לאחר הכביסה האחרונה, להשעות מחדש את גלולת התא המכיל MPC במיליליטר אחד של PBS לספירה ולהוסיף פעם אחת עשרה לש ששת התאים שכותרתו חמישה צינורות ציטומטריה זרימה מיליליטר. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ולהוסיף 100 microliters של הנוגדן המתאים של עניין, מדולל בתת פתרון דגירה נוגדנים לכל צינור.
מערבבים בעדינות את התאים עם כל קוקטייל נוגדנים נוסף במשך 10 שניות, ומ מניחים את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס, מוגנות מפני אור, במשך 20 דקות. בסוף הדגירה, צנטריפוגה הדגימות מחדש להשעות את כדורי 500 microliters של PBS בתוספת שני EDTA מילימולר. באמצעות פקדים תואמי isotype כדי להגדיר את כתמי הרקע, לנתח את הדגימות על ידי ציטומטריית זרימה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, gating על הלימפוציטים בעלילה פיזור קדימה לצד זה, כדי לא לכלול גרנולוציטים שיורית, פסולת תאית, וחלקיקים אחרים.
הגדר שער כך שיכיל מספר גבוה של תאים עם פנוטיפ CD34 חיובי ל- CD45. לאחר מכן, השתמש בשער CD34 חיובי CD34 חיובי כדי לבחור עבור קינאז הכנס קולטן תחום CD133 או CD184 חיובי תאים. לאחר מכן ניתן לזהות את אוכלוסיות המשנה של MPC על-ידי סמני פני התא הספציפיים שלהן ולדווח כאחוז האירועים המגודרים.
כדי לקבוע את הריכוז של סמנים ביולוגיים מסיסים בדגימות הדם שנאספו, ראשית, לשטוף את צלחות ELISA מצופה מראש המתאים פעמיים עם מאגר לשטוף המסופק על ידי ערכה ולתייג את תקן, מדגם, צינורות בקרה. צנטריפוגה דגימת הדם כדי להפריד את מרכיבי הדם aliquot הפלזמה לתוך צינורות מדגם. מעבירים את התקנים, הדגימות והבקרות ל בארות המתאימות וחותמים ודגירה את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.
בסוף הדגירה, להשליך את תכולת הבאר ולהוסיף את הנוגדן גילוי ביוטין לכל באר. לאחר דגירה של שעה ב 37 מעלות צלזיוס, להשליך את תכולת הצלחת ולשטוף את הבארים שלוש פעמים עם חיץ לשטוף טרי לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, הדגירה את הדגימות עם פתרון עבודה סטרפטוודין במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ואחריו שלוש שטיפות, כפי שהוכח.
לאחר הכביסה האחרונה, לטפל בדגימות עם מצע tetramethylbenzidine במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר הצבע מתפתח, להוסיף פתרון עצירה מהערכה ולקרוא את ספיגת צפיפות אופטית קורא ELISA מיקרופלאט. כדי לקבוע את הריכוז של אלפא גורם נמק הגידול, אינטרלוקין-1 בטא, באמצעות מולטיפלקסינג אימונומגנטי, תווית רגיל, מדגם, צינורות בקרה ומערבולת בקבוקונים חרוז מגנטי במשך 30 שניות.
מוסיפים חרוזים לבאנות המתאימות של צלחת ההתמדה המרובת. כאשר כל חרוזים נוספו, להכניס בבטחה את מכונת הכביסה צלחת מגנטית כף יד, ולחכות שתי דקות עבור חרוזים לצבור על החלק התחתון של כל באר, לפני היפוך מהיר הן מכונת כביסה מגנטית כף יד, ואת הרכבה צלחת מעל מיכל פסולת. לאחר מכן, להוסיף 150 microliters של חיץ לשטוף לכל באר ולחכות 30 שניות כדי לאפשר את חרוזים לצבור בתחתית.
השלך את התוכן שוב כפי שהוכח זה בלבד והוסף 25 מיקרוליטרים של מאגר בדיקה אוניברסלי ו- 25 מיקרוליטרים של הסטנדרטים, הדגימות והפקדים המוכנים. לאטום את הצלחת לפחות 60 דקות דגירה, מוגן מפני אור בטמפרטורת החדר, ו 500 סיבובים לדקה. בסוף הדגירה, מוסיפים 150 מיקרוליטרים של חיץ שטיפה לכל באר ומאפשרים לחדדים להתיישב במשך 30 שניות.
לאחר מכן, השתמש בכביסה כדי להשליך את תכולת הבאר ולתייג כל באר עם 25 microliters של תערובת נוגדנים זיהוי ואחריו שתי שטיפות, כפי שהודגם. לאחר הכביסה השנייה, הדגירה את הדגימות עם 25 microliters של סטרפטבידין PE במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, מוסיפים 120 מיקרוליטרים של חיץ קריאה לכל באר ואוטמים את הצלחת במשך חמש דקות דגירה, מוגנת מפני אור בטמפרטורת החדר, במשך 500 סיבובים לדקה.
לאחר מכן, לטעון את הצלחת על קורא מים multiplexing ולהתאים את פרמטרי הקריאה על פי כל analyte. כלילי, ונוס-סינוס, ודם היקפי נאספו מ 52 חולים שעברו אנגיוגרפיה כלילת והפגינו שכיחות גבוהה של יתר לחץ דם ודיסליפידמיה. הריכוז הכלילי הבסיסי של רוב MPCs היה נמוך משמעותית בחולים שפיתחו אירועי לב וכלי דם שליליים גדולים, עם ירידה גדולה יותר בתת-תפוקות MPC CD34 חיובי CD133 חיובי, ו- CD45 חיובי, CD34 חיובי, CD133 חיובי, CD184 חיובי.
כמו כן, חולים שפיתחו אירועי לב וכלי דם שליליים גדולים היו בסיס מוגבר בכמויות הכליליות של ICAM-1 מסיסים כמויות נמוכות יותר של חלבון metallomatrix 9. MPCs כליליים ו ICAM-1 מסיסים הפגינו יכולת פרוגנוסטית להישרדות גדולה ללא אירועים קרדיווסקולריים שליליים. מעניין, הביטוי של אלפא גורם נמק הגידול הפגינו וריאציות על פי זמן המדידה ואת המיקום של דגימה כלילית מבוסס על השוואה של אזורי לומן שונים באותו עורק הכלילי, באמצעות אולטרסאונד תוך וסקולרי.
במהלך בידוד MPC, הקפד להעביר את הדם על שיפוע הצפיפות, ולאסוף את התאים מהממשק לאחר צנטריפוגה בזהירות. מערבולת תקופתית מונעת משקעים של חרוזים ושימוש בכביסה מגנטית מסייע לשמור את חרוזים בתוך בארות במהלך שטיפה. MPCs כלילי ומולקולות מסיסים שימושיים עבור ריבוד הסיכון של אירועי לב וכלי דם במהלך מעקב לאחר אנגיופלסטיקה, סיוע במתן מניעות משניות לאנשים בסיכון גבוה כמו טכניקה זו משקפת את התהליך הפתופיזיולוגי המתרחשת במהלך הפסקת הפתרון, זה עשוי להיות שימושי עבור תנאים שבהם ביולוגיה של כלי הדם ממלא תפקיד.
