Sebbene l'angioplastica aiuti i pazienti con malattia coronarica, gli eventi cardiovascolari possono ancora verificarsi dopo la procedura. Poiché gli MPC e le molecole solubili sono ottenuti dalla circolazione coronarica, possono essere correlati al grado di danno vascolare e riparazione. L'MPC coronarica e i livelli di mediatore solubili possono quindi essere utilizzati per stimare eventi cardiovascolari e prognosi in pazienti con malattia coronarica sottoposta ad angioplastica coronarica.
Gli MPC e le molecole solubili possono anche essere usati per stimare complicazioni e prognosi che si verificano in diverse impostazioni ischemiche, come l'ictus ischimico degli arti ricorrente. A dimostrare la procedura saranno Eduardo Vera-Gomez e Alejandro Hernandez-Patricio, tecnici di laboratorio, e Karen De La Vega-Moreno e Carlos Zamora-Aleman, studenti universitari. Saranno inoltre manifestati Gabriela Alexandra Dominguez-Perez, studentessa di Master of Science, Alberto Melchor-Lopez, dottorando, e Mario Antonio Tellez-Gonzalez, collaboratore di Master of Science.
Entro un'ora dalla raccolta, trasferire sei millilitri del campione di sangue raccolto in un tubo conico da 15 millilitri e diluire il sangue con un rapporto uno a uno in PBS. Aggiungere due millilitri di gradiente di densità medio a tre provette e trasferire con cura tre aliquote uguali di sangue diluito in ogni tubo di mezzo gradiente di densità. Separare le cellule per centrifugazione e trasferire le cellule all'interfaccia in un nuovo tubo.
Lavare le cellule raccolte una volta in due millilitri di PBS per sei minuti, seguite da sei lavaggi in due millilitri di PBS fresco per lavaggio per due minuti. Dopo l'ultimo lavaggio, sospendere di nuovo il pellet di cellule contenente MPC in un millilitro di PBS per il conteggio e aggiungere uno per dieci alle sei celle etichettate cinque tubi di citometria a flusso millilitro. Pellet le cellule per centrifugazione e aggiungere 100 microlitri dell'anticorpo di interesse appropriato, diluito in soluzione di incubazione anticorpale ad ogni tubo.
Mescolare delicatamente le cellule con ogni cocktail anticorpale aggiunto per 10 secondi e posizionare i campioni a quattro gradi Celsius, protetti dalla luce, per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, centrifugare i campioni e sospendere nuovamente i pellet in 500 microlitri di PBS integrati con due EDTA millimolare. Utilizzando controlli abbinati all'isotipo per impostare la colorazione di fondo, analizzare i campioni per citometria a flusso secondo protocolli standard, gating sui linfociti in un grafico a dispersione avanti per lato, per escludere granulociti residui, detriti cellulari e altre particelle.
Impostare un gate per contenere un numero elevato di celle con un fenotipo CD34 positivo cd45-positivo. Utilizzare quindi il gate CD34-positive CD34-positive CD45 per selezionare per l'inserimento della chinasi il recettore del dominio CD133 o le cellule positive del CD184. Le sotto-popolazioni MPC possono quindi essere identificate dai loro specifici marcatori di superficie cellulare e riportate come la percentuale di eventi gated.
Per determinare la concentrazione di biomarcatori solubili nei campioni di sangue raccolti, in primo luogo, lavare due volte le piastre ELISA pre-rivestite appropriate con il tampone di lavaggio fornito dal kit ed etichettare i tubi standard, campione e di controllo. Centrifugare il campione di sangue per separare i componenti del sangue e aliquotare il plasma nei tubi del campione. Trasferire gli standard, i campioni e i controlli nei pozzi appropriati e sigillare e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 90 minuti.
Alla fine dell'incubazione, scartare il contenuto del pozzo e aggiungere l'anticorpo di rilevamento della biotina ad ogni pozzo. Dopo un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius, scartare il contenuto della piastra e lavare i pozzi tre volte con tampone di lavaggio fresco per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare i campioni con soluzione di lavoro Streptavidin per 30 minuti a 37 gradi Celsius seguita da tre lavaggi, come dimostrato.
Dopo l'ultimo lavaggio, trattare i campioni con substrato di tetrametilbenzidina per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quando il colore si sviluppa, aggiungere la soluzione di arresto dal kit e leggere l'assorbanza della densità ottica in un lettore ELISA micropiastra. Per determinare la concentrazione del fattore alfa della necrosi tumorale e dell'interleuchina-1 beta, usando il multiplexing immunomagnetico, etichettare i tubi standard, campione e di controllo e vortice le fiale magnetiche perline per 30 secondi.
Aggiungere perline ai pozzi appropriati della piastra di dosaggio multiplexing. Una volta aggiunte tutte le perline, inserire in modo sicuro la rondella magnetica portatile e attendere due minuti che le perline si accumulino sul fondo di ogni pozzo, prima di invertire rapidamente sia la rondella magnetica portatile che il gruppo piastra su un contenitore di rifiuti. Quindi, aggiungere 150 microlitri di tampone di lavaggio a ciascun pozzo e attendere 30 secondi per consentire alle perline di accumularsi sul fondo.
Scartare nuovamente il contenuto come appena dimostrato e aggiungere 25 microlitri di tampone universale per saggi e 25 microlitri degli standard, campioni e controlli preparati. Sigillare la piastra per un'incubazione di almeno 60 minuti, protetta dalla luce a temperatura ambiente, e 500 rotazioni al minuto. Alla fine dell'incubazione, aggiungere 150 microlitri di tampone di lavaggio ad ogni pozzo e lasciare che le perline si sistemino per 30 secondi.
Quindi, utilizzare la rondella per scartare il contenuto del pozzo ed etichettare ogni bene con 25 microlitri di miscela di anticorpi di rilevamento seguiti da due lavaggi, come dimostrato. Dopo il secondo lavaggio, incubare i campioni con 25 microlitri di Streptavidin PE per 30 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aggiungere 120 microlitri di tampone di lettura ad ogni pozzo e sigillare la piastra per un'incubazione di cinque minuti, protetta dalla luce a temperatura ambiente, per 500 rotazioni al minuto.
Quindi, caricare la piastra su un lettore di saggi multiplexing e regolare i parametri di lettura in base a ciascun alita. Coronarico, venere-seno e sangue periferico sono stati raccolti da 52 pazienti che sono stati sottoposti ad angiografia coronarica e hanno dimostrato un'alta prevalenza di ipertensione e dislipidemia. La concentrazione coronarica di base della maggior parte degli MPC è stata significativamente inferiore nei pazienti che hanno sviluppato importanti eventi cardiovascolari avversi, con una maggiore diminuzione delle sottopopolazioni MPC CD34-positivo CD133-positivo, e CD45-positivo, CD34-positivo, CD133-positivo, CD184-positivo.
Allo stesso modo, i pazienti che hanno sviluppato importanti eventi cardiovascolari avversi hanno avuto un aumento della linea di base nelle quantità coronarie di ICAM-1 solubile e quantità inferiori di proteina metallomatrix 9. Gli MPC coronari e l'ICAM-1 solubile hanno dimostrato una capacità prognostica per una maggiore sopravvivenza avversa senza eventi cardiovascolari. È interessante notare che l'espressione del fattore di necrosi tumorale alfa ha dimostrato variazioni in base al tempo di misurazione e alla posizione del campionamento coronarico basato su un confronto di diverse aree di lume nella stessa arteria coronarica, utilizzando ultrasuoni intravascolari.
Durante l'isolamento MPC, assicurarsi di trasferire il sangue sul gradiente di densità e di raccogliere le cellule dall'interfaccia dopo la centrifugazione con attenzione. Il vortice periodico previene la precipitazione delle perline e l'uso di una rondella magnetica aiuta a mantenere le perline all'interno dei pozzi durante i lavaggi. Gli MPC coronarici e le molecole solubili sono utili per stratificare il rischio di eventi cardiovascolari durante il follow-up dopo l'angioplastica, aiutando nella fornitura di prevenzione secondaria agli individui ad alto rischio in quanto questa tecnica riflette il processo fisiopatizzante che si verifica durante la cessazione della soluzione, potrebbe essere utile per le condizioni in cui la biologia vascolare gioca un ruolo.
