Bien que l’angioplastie aide des patients présentant la maladie coronaire, les événements cardio-vasculaires peuvent toujours se produire après la procédure. Comme les MPC et les molécules solubles sont obtenus à partir de la circulation coronaire, ils peuvent être corrélés au degré de dommages vasculaires et de réparation. Les niveaux coronaires de MPC et de médiateur soluble peuvent donc être utilisés pour estimer des événements cardio-vasculaires et le pronostic dans les patients présentant la maladie coronaire subissant des angioplasties coronaires.
Les MPCs et les molécules solubles peuvent également être utilisés pour estimer les complications et les pronostics qui se produisent dans différents milieux ischémiques, tels que l’AVC ischémique récurrent des membres. Eduardo Vera-Gomez et Alejandro Hernandez-Patricio, techniciens de laboratoire, ainsi que Karen De La Vega-Moreno et Carlos Zamora-Aleman, étudiants de premier cycle, feront la démonstration de la procédure. Gabriela Alexandra Dominguez-Perez, étudiante à la maîtrise en sciences, Alberto Melchor-Lopez, doctorant, et Mario Antonio Tellez-Gonzalez, collaborateur à la maîtrise en sciences, seront également de la partie.
Dans l’heure qui suit la collecte, transférer six millilitres de l’échantillon de sang récolté dans un tube conique de 15 millilitres et diluer le sang à un rapport d’un pour un dans PBS. Ajouter deux millilitres de gradient de densité moyen à trois tubes à essai et transférer soigneusement trois aliquots égaux de sang dilué dans chaque tube de milieu de gradient de densité. Séparez les cellules par centrifugation et transférez les cellules à l’interface vers un nouveau tube.
Lavez les cellules recueillies une fois en deux millilitres de PBS pendant six minutes, suivies de six lavages en deux millilitres de PBS frais par lavage pendant deux minutes. Après le dernier lavage, suspendre à nouveau la pastille cellulaire contenant du MPC dans un millilitre de PBS pour compter et ajouter une fois dix aux six cellules aux tubes de cytométrie à débit de cinq millilitres étiquetés. Pelleter les cellules par centrifugation et ajouter 100 microlitres de l’anticorps approprié d’intérêt, dilué dans la solution d’incubation d’anticorps à chaque tube.
Mélanger délicatement les cellules avec chaque cocktail d’anticorps ajouté pendant 10 secondes, et placer les échantillons à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière, pendant 20 minutes. À la fin de l’incubation, centrifuger les échantillons et suspendre à nouveau les granulés dans 500 microlitres de PBS complétés par deux millimolaires EDTA. À l’aide de contrôles appariés à l’isotype pour mettre en place la coloration de fond, analyser les échantillons par cytométrie d’écoulement selon les protocoles standard, gating sur les lymphocytes dans une parcelle de dispersion avant par côté, pour exclure les granulocytes résiduels, les débris cellulaires, et d’autres particules.
Réglez une porte pour contenir un nombre élevé de cellules avec un phénotype CD45-positif CD34-positif. Ensuite, utilisez la porte CD34-positive CD34-positive cd45 pour sélectionner pour kinase insérer récepteur de domaine CD133 ou CD184 cellules positives. Les sous-populations de MPC peuvent alors être identifiées par leurs marqueurs spécifiques de surface cellulaire et signalées comme le pourcentage d’événements fermés.
Pour déterminer la concentration de biomarqueurs solubles dans les échantillons de sang prélevés, lavez d’abord les plaques ELISA préendues appropriées deux fois avec le tampon de lavage fourni par kit et étiquetez les tubes standard, échantillon et contrôle. Centrifugez l’échantillon de sang pour séparer les composants sanguins et aliquot le plasma dans les tubes de l’échantillon. Transférez les normes, les échantillons et les contrôles aux puits appropriés et scellez et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes.
À la fin de l’incubation, jeter le contenu du puits et ajouter l’anticorps de détection de biotine à chaque puits. Après une incubation d’une heure à 37 degrés Celsius, jetez le contenu de la plaque et lavez les puits trois fois avec un tampon de lavage frais par lavage. Après le dernier lavage, incuber les échantillons avec streptavidine solution de travail pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius suivie de trois lavages, comme démontré.
Après le dernier lavage, traiter les échantillons avec du substrat de tétraméthylbenzidine pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque la couleur se développe, ajouter la solution stop du kit et lire l’absorption de densité optique dans un lecteur ELISA microplaqué. Pour déterminer la concentration du facteur alpha de nécrose de tumeur, et de bêta d’interleukin-1, utilisant le multiplexage immunomagnétique, étiquetez la norme, échantillon, et contrôlez des tubes et vortex les flacons magnétiques de perle pendant 30 secondes.
Ajouter des perles aux puits appropriés de la plaque d’analyse multiplexe. Lorsque toutes les perles ont été ajoutées, insérez solidement la laveuse à plaque magnétique portatif et attendez deux minutes que les perles s’accumulent au fond de chaque puits, avant d’inverser rapidement la laveuse à plaque magnétique portatif et l’assemblage de la plaque sur un conteneur à déchets. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de tampon de lavage à chaque puits et attendez 30 secondes pour permettre aux perles de s’accumuler sur le fond.
Jetez le contenu à nouveau comme il vient de le démontrer et ajoutez 25 microlitres de tampon d’analyse universel et 25 microlitres des normes préparées, des échantillons et des contrôles. Sceller la plaque pendant au moins 60 minutes d’incubation, à l’abri de la lumière à température ambiante, et 500 rotations par minute. À la fin de l’incubation, ajouter 150 microlitres de tampon de lavage à chaque puits et laisser les perles se contenter de 30 secondes.
Ensuite, utilisez la laveuse de plaque pour jeter le contenu du puits et étiquetez chaque puits avec 25 microlitres de mélange d’anticorps de détection suivis de deux lavages, comme démontré. Après le deuxième lavage, incuber les échantillons avec 25 microlitres de Streptavidin PE pendant 30 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, ajouter 120 microlitres de tampon de lecture à chaque puits et sceller la plaque pendant une incubation de cinq minutes, protégée de la lumière à température ambiante, pendant 500 rotations par minute.
Ensuite, chargez la plaque sur un lecteur d’analyse multiplexe et ajustez les paramètres de lecture en fonction de chaque analyte. Coronaire, vénus-sinus, et le sang périphérique ont été rassemblés de 52 patients qui ont subi l’angiographie coronaire et ont démontré une prédominance élevée de l’hypertension et du dyslipidemia. La concentration coronaire de base de la plupart des MPCs était sensiblement inférieure dans les patients qui ont développé des événements cardio-vasculaires défavorables principaux, avec une plus grande diminution des sous-populations de MPC CD34-positif CD133-positif, et CD45-positif, CD34-positif, CD133-positif, CD184-positif.
De même, les patients qui ont développé des événements cardio-vasculaires défavorables principaux ont eu une ligne de base accrue dans les quantités coronaires de l’ICAM-1 soluble et des quantités inférieures de protéine de métallomatrix 9. Les MPCs coronaires et l’ICAM-1 soluble ont démontré une capacité pronostique pour la survie cardio-vasculaire principale sans événement. Fait intéressant, l’expression du facteur alpha de nécrose de tumeur a démontré des variations selon le temps de mesure et l’endroit de l’échantillonnage coronaire basé sur une comparaison des différentes secteurs de lumen à la même artère coronaire, utilisant l’ultrason intravasculaire.
Pendant l’isolement de MPC, assurez-vous de transférer le sang sur le gradient de densité, et de recueillir les cellules de l’interface après centrifugation soigneusement. Le vortex périodique empêche les précipitations de perles et l’utilisation d’une laveuse à plaques magnétiques aide à garder les perles à l’intérieur des puits pendant les lavages. Les MPCs coronaires et les molécules solubles sont utiles pour stratifier le risque d’événements cardiovasculaires pendant le suivi après l’angioplastie, aidant à fournir des préventions secondaires aux individus à haut risque car cette technique reflète le processus pathophysiologique qui se produit pendant l’arrêt de la solution, elle pourrait être utile pour les conditions dans lesquelles la biologie vasculaire joue un rôle.
