Obwohl Die Angioplastie Patienten mit koronaren Herzkrankheiten hilft, können kardiovaskuläre Ereignisse auch nach dem Eingriff auftreten. Da MPCs und lösliche Moleküle aus der koronaren Zirkulation gewonnen werden, können sie mit dem Grad der Gefäßschäden und der Reparatur korreliert werden. Koronare MPC- und lösliche Mediator-Spiegel können daher verwendet werden, um kardiovaskuläre Ereignisse und Prognose bei Patienten mit koronaren Herzerkrankungen zu schätzen, die sich einer koronaren Angioplasie unterziehen.
MPCs und lösliche Moleküle können auch verwendet werden, um Komplikationen und Prognosen zu schätzen, die unter verschiedenen ischämischen Einstellungen auftreten, wie zum Beispiel rezidivierender Gliedmaßen-Ischmiary-Schlag. Demonstriert werden Eduardo Vera-Gomez und Alejandro Hernandez-Patricio, Labortechniker, sowie Karen De La Vega-Moreno und Carlos Zamora-Aleman, Studenten unter der Klasse. Mit dabei sind auch Gabriela Alexandra Dominguez-Perez, Master-Studentin der Naturwissenschaften, Alberto Melchor-Lopez, Doktorand, und Mario Antonio Tellez-Gonzalez, ein Master-Mitarbeiter für Wissenschaft.
Innerhalb einer Stunde nach der Entnahme sechs Milliliter der geernteten Blutprobe in eine 15 Milliliter konische Röhre übertragen und das Blut in PBS im Verhältnis eins zu eins verdünnen. Fügen Sie zwei Milliliter DichteGradientmedium zu drei Reagenzgläsern hinzu und übertragen Sie sorgfältig drei gleiche Aliquots verdünntes Blut in jedes Rohr mit Dichtegradientenmedium. Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation und übertragen Sie die Zellen an der Schnittstelle in ein neues Rohr.
Waschen Sie die gesammelten Zellen einmal in zwei Milliliter PBS für sechs Minuten, gefolgt von sechs Wäschen in zwei Millilitern frischer PBS pro Wäsche für zwei Minuten. Nach der letzten Wäsche das MPC-haltige Zellpellet in einem Milliliter PBS zum Zählen wieder aufsetzen und den sechs Zellen ein mal zehn zu den markierten Fünf-Milliliter-Flow-Zytometrieröhren hinzufügen. Pellet die Zellen durch Zentrifugation und fügen Sie 100 Mikroliter des entsprechenden Antikörpers von Interesse, in Antikörper-Inkubationslösung zu jeder Röhre verdünnt.
Mischen Sie die Zellen mit jedem zugesetzten Antikörpercocktail für 10 Sekunden und legen Sie die Proben bei vier Grad Celsius, geschützt vor Licht, für 20 Minuten. Zentrifugieren Sie am Ende der Inkubation die Proben und setzen Sie die Pellets in 500 Mikroliter PBS wieder auf, ergänzt durch zwei Millimolar EDTA. Analysieren Sie die Proben mithilfe isotypübereinstimmender Steuerelemente, um die Hintergrundfärbung einzurichten, anhand von Durchflusszytometrie gemäß Standardprotokollen, indem Sie die Lymphozyten in einem vorwärts-neben-Seiten-Streudiagramm verkleben, um Restpartikel, Zellablagerungen und andere Partikel auszuschließen.
Legen Sie ein Tor fest, das eine hohe Anzahl von Zellen mit einem CD45-positiven CD34-positiven Phänotyp enthält. Als Nächstes verwenden Sie das CD45-positive CD34-positive Gate, um für Kinase-Insert-Domänenrezeptor-CD133- oder CD184-positive Zellen auszuwählen. Die MPC-Unterpopulationen können dann anhand ihrer spezifischen Zelloberflächenmarker identifiziert und als Prozentsatz der gated Ereignisse gemeldet werden.
Um die Konzentration von löslichen Biomarkern in den gesammelten Blutproben zu bestimmen, waschen Sie zunächst die entsprechenden vorbeschichteten ELISA-Platten zweimal mit dem mit dem Kit bereitgestellten Waschpuffer und beschriften Sie die Standard-, Proben- und Steuerröhrchen. Zentrifuge die Blutprobe, um die Blutbestandteile zu trennen und das Plasma in die Probenröhrchen zu aliquote. Übertragen Sie die Normen, Proben und Kontrollen auf die entsprechenden Brunnen und versiegeln und bebrüten die Platte bei 37 Grad Celsius für 90 Minuten.
Am Ende der Inkubation den Brunneninhalt entsorgen und den Biotin-Detektionsantikörper in jeden Brunnen geben. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37 Grad Celsius den Platteninhalt entsorgen und die Brunnen dreimal mit frischem Waschpuffer pro Waschgang waschen. Nach der letzten Wäsche, inkubieren Sie die Proben mit Streptavidin Arbeitslösung für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius gefolgt von drei Wäschen, wie gezeigt.
Nach der letzten Wäsche die Proben mit Tetramethylbenzidinsubstrat 30 Minuten bei 37 Grad Celsius behandeln. Wenn sich die Farbe entwickelt, fügen Sie die Stop-Lösung aus dem Kit hinzu und lesen Sie die optische Dichteabsorption in einem Mikroplatten-ELISA-Reader. Um die Konzentration des Tumornekrosefaktors alpha und Interleukin-1 beta mit hilfe immunmagnetischem Multiplexing zu bestimmen, beschriften Sie die Standard-, Proben- und Steuerröhrchen und wirbeln die magnetischen Perlenfläschchen 30 Sekunden lang.
Fügen Sie Perlen zu den entsprechenden Brunnen der Multiplexing-Assay-Platte hinzu. Wenn alle Perlen hinzugefügt wurden, legen Sie die Handscheibe der magnetischen Plattenscheibe sicher ein und warten Sie zwei Minuten, bis sich die Perlen auf der Unterseite jedes Brunnens ansammeln, bevor Sie schnell sowohl den Handscheibenscheibenbecher als auch die Plattenmontage über einem Abfallbehälter umkehren. Als nächstes fügen Sie 150 Mikroliter Waschpuffer zu jedem Brunnen hinzu und warten Sie 30 Sekunden, damit sich die Perlen auf dem Boden ansammeln.
Entsorgen Sie den Inhalt wieder, wie gerade gezeigt, und fügen Sie 25 Mikroliter universellen Assaypuffer und 25 Mikroliter der vorbereiteten Standards, Proben und Kontrollen hinzu. Versiegeln Sie die Platte für eine mindestens 60-minütige Inkubation, die bei Raumtemperatur vor Licht geschützt ist, und 500 Umdrehungen pro Minute. Am Ende der Inkubation 150 Mikroliter Waschpuffer zu jedem Brunnen hinzufügen und die Perlen für 30 Sekunden begleichen lassen.
Verwenden Sie dann die Plattenscheibe, um den Brunneninhalt zu entsorgen und jeden Brunnen mit 25 Mikrolitern Detektionsantikörper-Mischung, gefolgt von zwei Waschungen, zu kennzeichnen, wie gezeigt. Nach der zweiten Wäsche die Proben mit 25 MikroliterStreptavidin PE 30 Minuten bei Raumtemperatur bebrüten. Am Ende der Inkubation 120 Mikroliter Lesepuffer zu jedem Brunnen hinzufügen und die Platte für eine fünfminütige Inkubation, geschützt vor Licht bei Raumtemperatur, für 500 Umdrehungen pro Minute versiegeln.
Laden Sie dann die Platte auf einen Multiplexing-Assay-Reader und passen Sie die Leseparameter an jeden Analyten an. Koronare, Venus-Sinus und peripheres Blut wurden von 52 Patienten entnommen, die einer koronaren Angiographie unterzogen wurden und eine hohe Prävalenz von Bluthochdruck und Dyslipidämie zeigten. Die koronare Ausgangskonzentration der meisten MPC war bei Patienten, die große unerwünschte kardiovaskuläre Ereignisse entwickelten, signifikant niedriger, mit einem größeren Rückgang der MPC-Subpopulationen CD34-positiv CD133-positiv und CD45-positiv, CD34-positiv, CD133-positiv, CD184-positiv.
Ebenso hatten Patienten, die große unerwünschte kardiovaskuläre Ereignisse entwickelten, eine erhöhte Ausgangsbasis in koronaren Mengen an löslichem ICAM-1 und geringere Mengen an Metallomatrix-Protein 9. Koronare MPCs und lösliches ICAM-1 zeigten eine prognostische Fähigkeit für ein schweres kardiovaskuläres ereignisfreies Überleben. Interessanterweise zeigte die Expression des Tumornekrosefaktors Alpha Variationen je nach Messzeitpunkt und der Lage der koronaren Probenahme auf der Grundlage eines Vergleichs verschiedener Lumenbereiche an derselben Herzkranzgefäße mit intravaskulärem Ultraschall.
Achten Sie während der MPC-Isolierung darauf, das Blut auf den Dichtegradienten zu übertragen und die Zellen nach der Zentrifugation sorgfältig von der Schnittstelle zu sammeln. Periodische Wirbel verhindert Perlenfällung und die Verwendung einer magnetischen Plattenscheibe hilft, die Perlen in den Brunnen während der Wäsche zu halten. Koronare MPCs und lösliche Moleküle sind nützlich, um das Risiko kardiovaskulärer Ereignisse während der Nachbeobachtung nach der Angioplastie zu stratieren und bei der Bereitstellung von sekundären Präventionen für Personen mit hohem Risiko zu unterstützen, da diese Technik den pathophysiologischen Prozess widerspiegelt, der während des Lösungsstopps auftritt, es könnte für Bedingungen nützlich sein, bei denen die Gefäßbiologie eine Rolle spielt.
