Para enfermedades neonatales como la cardiomiopatía, la terapia regenerativa que utiliza células derivadas de células madre pluripotentes inducidas tiene un potencial masivo. Sin embargo, el crecimiento celular acelerado in vitro conduce al daño del ADN por metabolitos acumulados como especies reactivas de oxígeno. El trasplante de estas células dañadas por el ADN resultaría en un injerto deficiente y regeneración del órgano.
Antes del trasplante, se debe evaluar la calidad de las células. Aquí proporcionamos dos protocolos paso a paso para evaluar el daño del ADN en las células madre. Demostrando los procedimientos estarán Jessica Miller, una investigadora, Nikhil Mardhekar, investigadora, y Vasanthi Rajasekaran, un técnico de laboratorio.
Para empezar, coloque 500 miligramos de agarosa de baja fusión en 100 mililitros de agua libre de ARN de ADN. Calienta la botella en un horno microondas hasta que la agarosa se disuelva. A continuación, coloque la botella en un baño de agua de 37 grados centígrados hasta que sea necesario.
Para preparar portaobjetos pre-recubiertos, coloque unas gotas de 0.5% de agarosa en un portaobjetos de vidrio. Esparce inmediatamente la agarosa para formar una fina capa de recubrimiento de agarosa usando un cubreobjetos. Trabajando bajo condiciones de poca luz para evitar daños en las células inducidas por luz ultravioleta, mezcle 10 microlitros de suspensión celular y 90 microlitros de solución de agarosa en un tubo.
Coloque el tubo en un baño de agua de 37 grados Celsius para evitar que la agarosa se solidifice. Mezclar la solución sin introducir burbujas de aire y pipetear 70 microlitros por punto en el portaobjetos pre-revestido. Usando una punta de pipeta, esparza la mezcla de agarosa celular para formar una capa delgada.
Coloque la corredera a cuatro grados Centígrados durante 15 minutos. En un contenedor, sumerja completamente la diapositiva en un búfer de lelisis fría. Coloque el recipiente en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante una hora.
Sustituya el búfer de lelisis por una solución alcalina fría. Asegúrese de que las diapositivas estén completamente sumergidas. Después de dejar el recipiente en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante otros 30 minutos, coloque el portaobjetos en un tanque de electroforesis horizontal.
Llene el tanque con tampón de electroforesis alcalino frío hasta que las diapositivas estén completamente sumergidas. Aplique tensión a un voltio por centímetro durante 15 a 30 minutos. En un recipiente, sumerja completamente el tobogán en agua fría desionizada.
Después de dos minutos, retire el agua desionizada y agregue agua fresca desionizada, y luego repita este paso una segunda vez. A continuación, reemplace el agua desionizada por un 70% de etanol frío. Después de cinco minutos, retire suavemente el portaobjetos sin inclinarlo y déjelo secar al aire.
Una vez secado, añadir 100 microlitros de tinte de ADN diluido a cada punto, y esperar 15 minutos a temperatura ambiente. Usando un filtro FITC en un microscopio de epifluorescencia, tome imágenes de 50 a 100 cometas en total por muestra. Cultivo iPS-derivados de cardiomiocitos como se describe en el protocolo de texto.
Para ver los cardiomiocitos derivados de iPS en diapositivas de cámara, primero deseche el medio de cultivo de los pozos y lave las células tres veces con PBS. Añadir un mililitro de 0.25%Trypsin por pozo, e incubar a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Compruebe la placa bajo un microscopio para el desprendimiento de células.
A continuación, agregue un mililitro de MMC para detener el Trypsin. Coloque la suspensión celular en un tubo de 15 mililitros y centrifugar durante cinco minutos a cuatro grados Centígrados y 200 veces g. Deseche el medio, agregue un mililitro de MMC y resuspend las células.
Cuente las células y ajuste el recuento de células para obtener dos millones de células en 1,6 mililitros de MMC. Ahora siembra 200 microlitros de suspensión celular por pozo de la corredera de ocho pozos. Toque suavemente la diapositiva para extender las células alrededor del pozo.
Incubar las células a 37 grados centígrados. Para el tratamiento de doxorubicina de cardiomiocitos derivado de iPS, deseche el medio de cultivo de los pozos de cardiomiocitos derivados del iPS y lave las células con PBS. Tratar las células con doxorubicina de un micromolar durante cuatro horas a 37 grados centígrados.
Aspirar el medio y lavar las células con PBS. Para realizar el inmunoetiquetado, lave las células tres veces con PBS y agregue 200 microlitros de 4%paraformaldehído recién preparados a cada pozo. Fijar las celdas durante 20 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
Después de lavar las células con PBS, agregue 200 microlitros de tampón de bloqueo por pozo, y bloquee durante 30 minutos en una cámara humidificada a temperatura ambiente. Retire el tampón de bloqueo y añada 200 microlitros de solución primaria de anticuerpos. Después de incubar durante 45 minutos en una cámara húmeda oscura a temperatura ambiente, lave los pozos tres veces con PBS.
Retire el PBS y añada 200 microlitros de mezcla de anticuerpos secundarios. Incubar durante 45 minutos en una cámara húmeda oscura a temperatura ambiente. A continuación, lave los pozos tres veces con PBS.
Lavar con agua desionizada antes de montar los portaobjetos con antifade. Coloque un vaso de cubierta y guarde los portaobjetos en la oscuridad a cuatro grados centígrados. Usando un microscopio confocal, tome de tres a cinco imágenes de campos aleatorios por muestra y proceda al análisis de imágenes.
Para contar los focos de respuesta al daño del ADN, descargue e instale CellProfiler. Seleccione file, import, pipeline from the file y elija el archivo de canalización denominado puncti gamma-H2AX. Arrastre y suelte la carpeta que contiene las imágenes adquiridas de los focos gamma-H2AX a la ventana de lista de archivos en la sección de imágenes de módulos de entrada para su análisis.
A continuación, siga las instrucciones que se muestran en el protocolo de texto. Para establecer los parámetros de las imágenes, arrastre la imagen deseada para su análisis a la lista de archivos. En módulos de entrada, seleccione imágenes.
También en los módulos de entrada, seleccione metadatos y, a continuación, seleccione nombres y tipos. Para grupos, seleccione no. Trabajando en módulos de análisis, seleccione el color a gris.
A continuación, seleccione suave, seleccione identificar objetos primarios y, de nuevo, seleccione suavizado. A continuación, seleccione mejorar o suprimir operaciones y, a continuación, seleccione identificar objetos primarios. Sigue trabajando en módulos de análisis, selecciona relacionar objetos, luego clasifica objetos y, finalmente, selecciona exportar a hoja de cálculo.
Haga clic en Analizar imágenes en el panel inferior izquierdo para realizar análisis de imágenes. Al completar correctamente el análisis, se generan varias imágenes. Tenga en cuenta el archivo CSV que se genera y se guarda en la ubicación adecuada en el equipo.
Este archivo contiene los datos cuantitativos para su análisis posterior. En la hoja de cálculo llamada mi imagen de experimento, la columna B tendrá el número de núcleos que tienen hasta cinco puncti, y la columna D tendrá el número de núcleos que tienen más de cinco puncti. Agregue las columnas B y D para obtener el número total de núcleos.
Repita estos pasos para todas las imágenes, cambiando el nombre de archivo de mi experimento antes de cada análisis. Aquí se muestran micrografías representativas de cometas de células iPS tratadas con doxo y no tratadas. Se encontró una cantidad basal de daño en el ADN en las células iPS, expresada como una fracción del daño del ADN y el momento de la cola.
Sin embargo, el tratamiento con doxo aumentó el daño del ADN en las células iPS como se esperaba, lo que indica que el ensayo del cometa se puede utilizar para evaluar la integridad del ADN en células madre pluripotentes. Las micrografías representativas del inmunoetiquetado gamma-H2AX se muestran aquí, con un aumento más bajo y con un aumento más alto. En el control de cardiomiocitos derivados de iPS, más del 90% de las células tenían menos de cinco focos DDR por núcleo.
Y un total de menos del 10% de las células tenían más de seis focos DDR por núcleo. Para los cardiomiocitos derivados de iPS cultivados durante seis meses, menos del 90% de las células tenían hasta cinco focos DDR por núcleo, y un total de más del 13% de las células tenían más de seis focos DDR por núcleo. Mientras que en los cardiomiocitos derivados de iPS tratados con doxo, menos del 80% de las células tenían hasta cinco focos de DDR por núcleo.
Y un total de aproximadamente el 24% de las células tenían más de seis focos DDR por núcleo. Estos datos indican que el cultivo prolongado de células cardiomiocitos derivadas de iPS y el tratamiento con doxo indujeron un daño significativo en el ADN, haciéndolos inadecuados para el trasplante celular. Es muy importante evitar las variables mientras se mezcla la suspensión celular, ya que esto podría afectar la electroforesis.
Siguiendo este procedimiento, puede realizar los ensayos de cometas y los procedimientos de inmunoetiquetado con células de varios tipos. Estas técnicas permitirán evaluar las células de varios tipos para el daño del ADN antes de ser utilizadas en estudios de trasplante celular.
