El protocolo proporciona un método de cultivo de células primarias fácil de manejar y ampliamente compatible para los invertebrados marinos. Esta técnica ofrece a los investigadores una manera de cultivar las células invertebradas marinas durante un tiempo relativamente largo. Se debe proporcionar un cultivo de células con antecedentes genéticos consistentes para diferentes aplicaciones experimentales biológicas adicionales en la investigación de la biología marina.
Para la nueva investigación en este campo, creemos que el protocolo simplificado indicado debe ser la buena opción para ejercer. Después de la anestesia, disecciona y recoja los intestinos anteriores, luego secciona las muestras de tejido verticalmente y eliminar el contenido interno. Lave las muestras de tejido en PBS dos veces y desinfectelas por inmersión en una solución de etanol al 75% durante no más de dos segundos.
Luego lave las muestras de tejido en PBS tres veces para extraer el etanol, y transfiera alrededor de 100 miligramos de muestra de tejido en un tubo de micro centrífuga estéril de dos mililitros. Añadir 1,5 mililitros de medio de cultivo pre-optimizado al bloque de tejido intestinal de pepino de mar y picar el bloque con tijeras quirúrgicas esterilizadas hasta que la solución esté turbia. Añadir 400 microlitros de 0,25% de trippsina.
Mezclar la solución por inversión e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, filtre la solución con un colador celular de 100 micras y recoja el filtrado en un nuevo tubo estéril de micro centrífuga de dos mililitros. Para el protocolo simplificado opcional, los bloques de tejido cortados en medios cultivados se pueden transferir directamente a los platos y posteriormente incubar.
Centrifugar el tubo a 1700xG durante tres minutos, desechar el sobrenadante, luego volver a suspender el pellet en un medio de cultivo con antibióticos, y lavarlo con medio de cultivo dos veces. Preconfigurar la incubadora para el cultivo celular, y ejecutarla con antelación durante al menos 24 horas con la temperatura de 18 grados centígrados y la humedad saturada. Luego vuelva a suspender las células usando 200 microlitros del medio indicado, y transfiéralas a platos de cuatro centímetros.
Cultivo de las células en una incubadora. Después de seis horas, sáquelos de la incubadora y agregue dos mililitros de medio indicado a los platos de cultivo de la célula. Cada 12 horas, cambia la mitad del medio.
Después de cinco a siete días, las células comienzan a dividirse. Reducir los efectos adversos de los antibióticos mediante la reducción de la concentración de antibióticos indicados, penicilina, estreptomicina, y gentamicina en el medio de cultivo a la mitad. Cada dos o tres días, reemplace el medio de cultivo celular.
Cuando la densidad de la célula primaria alcanza el 60%, realice el passaging de células. Primero, lave las células cultivadas dos veces usando PBS a temperatura ambiente. Añadir 200 microlitros de 0.25% solución de trippsina a cada plato, y agitar manualmente los platos, asegurando que todo el fondo esté cubierto.
Deseche la solución de tripsina e incubar las células durante cinco minutos a temperatura ambiente. Lavar las células con un mililitro de medio de cultivo fresco pipeteando y suspendiendo las células. Transfiera 0,5 mililitros de suspensión celular a un nuevo plato.
Añadir 1,5 mililitros de medio fresco, e incubar las células a 18 grados centígrados. Después de 12 horas, cambie el medio y observe las células bajo un microscopio para evaluar las condiciones. Preparar tres grupos experimentales, incluyendo un control, y dos grupos de soluciones, con un micromolar y 100 deximetazona micromolar.
Después de la incubación con o sin deximetazona durante cero, 24 o 48 horas, lave las células tres veces con PBS. Después de apagar la luz, agregue 300 microlitros de solución hoechst 33258 por pozo a una placa de 12 pozos, y agitar suavemente la placa para cubrir todas las células, asegurando su tinción. Incubar a 18 grados centígrados durante 30 minutos.
A continuación, retire la solución de tinción de hoechst y fije las células añadiendo 300 microlitros de solución de paraformaldehído al cuatro por ciento en PBS a cada pozo. Agitar suavemente durante 15 minutos. Después de eso, lave las células fijas tres veces en PBS.
Mantenga el PBS después del último lavado para mantener las células cubiertas. Encienda el hardware del microscopio fluorescente, incluida la potencia de la lámpara de mercurio, la potencia de luz fluorescente y el PC. Inicie sesión en la cuenta del sistema operativo, inicie el software y compruebe su configuración. Coloque la placa preparada en la etapa del microscopio.
Coloque la muestra sobre el objetivo con el controlador de escenario. Encuentra las células de interés bajo el microscopio de luz. Cambie a la microscopía fluorescente y ajuste los parámetros de la excitación y emisión a aproximadamente 352 y 461 nanómetros, respectivamente, para la observación del ADN de los núcleos.
Captura las imágenes. En este estudio, se estableció y se hizo un paso del cultivo celular intestinal primario del pepino de mar. Las células redondas en diferentes etapas de cultivo se muestran aquí.
Aquí hay celdas unidas a la parte inferior de los platos en el tercer día, después de ser sembrado. Aquí está la proliferación celular en el séptimo día. Aquí hay celdas unidas a la parte inferior de los platos después de pasar.
Y células que perdieron actividad y estaban muriendo después de 10 pasajes. Los ensayos de encción de la EDU proporcionan evidencia directa para revelar la actividad proliferativa de estas células redondas en etapas posteriores. La estimulación con una deximetazona micromolar aumentó la velocidad celular apoptótica más rápidamente, en comparación con el control y la estimulación de deximetazona micromolar 100.
Las células cultivadas fueron tratadas con dexmetazona durante diferentes períodos de tiempo, seguido de la tinción hoechst 33258 para la detección de células apoptóticas. Los tratamientos celulares antes de la incubación son críticos para el control a largo plazo. Es un recordatorio para probar el protocolo simplificado opcional cuando la célula no crece bien.
El paraformaldehído es moderadamente tóxico por contacto o inhalación de la piel, y está documentado como un carcinógeno probablemente humano.
