Yan popülasyon hücrelerinin analizi, kanser kök hücrelerini tümör dokularından ve tümör hücre çizgilerinden izole etmek ve tanımlamak için yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biridir. Bu test kullanışlı, hızlı ve uygun maliyetlidir. Bu yöntem, genlerin veya diğer hücre dışı ve hücre içi sinyallerin tümör hücrelerinin köklük özellikleri üzerindeki etkisinin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Birçok faktör bu analizde SP hücrelerinin yüzdesini etkileyebilir, bu nedenle resmi deneyden önce uygun koşulları araştırmak önemlidir. Tümör hücrelerini altı kuyulu bir tabakta tohumlayın ve %5 karbondioksitle birlikte verilen 37 santigrat derecelik bir inkübatörde kuluçkaya yatır. Hücre yoğunluğu yaklaşık% 90'a ulaştığında kültür ortamını aspire edin ve hücreleri üç mililitre PBS ile iki kez yıkayın.
Ardından, her kuyuya% 0.25 tripsin-EDTA'nın 500 mikrolitresini ekleyin ve plakayı bir ila üç dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya bırakın. Hücreleri ayırmak için plakaya hafifçe dokunun, her kuyuya%2 FBS ile desteklenmiş üç mililitre PBS ekleyin ve hücre kümelerini dağıtmak için hücreleri üç ila beş kez yukarı ve aşağı borulayın. Hücre süspansiyonu mikroskop altında incele.
Hücre kümeleri varsa, süspansiyonu 70 mikrometrelik bir süzgeçten geçirin. Hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve beş dakika boyunca 200 kez g'da santrifüjleyin. Üstnatantı çıkarın ve hücreleri %2 FBS ile desteklenmiş üç mililitre PBS'de yeniden biriktirin ve hücreleri karıştırmak için üç ila beş kez yukarı ve aşağı pipetleme.
Hemositometre kullanarak mikroskop altındaki hücreleri sayın ve mililitre başına altı hücreye bir kez 10 kez nihai konsantrasyona% 2 FPS ile desteklenmiş PBS'de seyreltin. İki adet beş mililitre, polistiren, yuvarlak tabanlı test tüpleri hazırlayın ve her tüpe bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin. Bir tüpü test tüpü, diğerini engelleyici kontrol tüpü olarak etiketle.
Uygun konsantrasyona seyrelterek bir bloker çözeltisi hazırlayın. Bloker kontrol tüpüne ekleyin ve iyice karıştırın, ardından tüpü 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya bırakın. Tüpü her 10 dakikada bir sallayın.
Uygun konsantrasyona seyrelterek Hoechst 33342 çözeltisi hazırlayın. Test tüpüne ve bloker kontrol tüpüne ayrı ayrı ekleyin ve iyice karıştırın, ardından tüpleri 37 santigrat derecede 60 dakika kuluçkaya bırakın. Tüpleri her 10 dakikada bir sallayın.
Kuluçkadan sonra, hücreleri 200 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin, ardından süpernatantı dikkatlice epire edin. Her tüpteki hücreleri%2 FBS ile desteklenmiş bir mililitre buz gibi PBS ile yeniden depolayın, ardından karıştırmak için hücreleri yukarı ve aşağı borulayın. Her tüpe mililitre başına bir miligram propidium iyot veya PI mikrolitre ekleyin ve karıştırın.
Akış sitometresi yazılımında Parametreler sekmesini tıklatın. İlk olarak, sırasıyla FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red ve PI parametrelerini seçin. İkinci olarak, PI parametresi için logaritmik ölçeği seçin.
Son olarak, sırasıyla FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red ve PI parametreleri için alan ve genişlik ölçeklerini seçin. Hücreleri önce test tüpünden çalıştırın, sonra aynı voltajları ve kapıları kullanarak bloker kontrol tüpünden hücreleri çalıştırın. SP hücrelerinin yüzdesini analiz etmek için her örnekten 20 ila 100.000 olay toplayın.
Bu yöntem MDA-MB-231 insan meme kanseri hücre hattındaki SP hücrelerinin oranını tespit etmek için kullanılmıştır. FSC-A ile PI-A arasındaki nokta grafiği, daha fazla analize tabi tutulan ölü hücre, hücre enkazı ve PI negatif hücrelerinin ana popülasyonu popülasyonu gösterdi. Tedavi edilmeyen hücrelerde yaklaşık %0,9 ve reserpine ile tedavi edilen hücrelerde yaklaşık %0,09 olan SP hücrelerinin oranını analiz etmek için FSC-A ile FSC-W ve SSC-A'nın noktasal grafiğinden kapılı tek bir hücre popülasyonu kullanıldı.
Hoechst 33342'nin farklı boyama konsantrasyonları MDA-MB-435 hücreleri üzerinde test edildi ve mililitre başına iki mikrogramın SP analizi için en uygun olduğu belirlendi. Düşük konsantrasyonlar SP hücrelerini diğer popülasyonlardan ayırt etmeyi zorlaştırırken, yüksek konsantrasyonlar SP hücrelerinin kaybolmasına neden oldu. MDA-MB-435 hücreleri için uygun engelleyiciyi belirlemek için verapamil ve reserpine test edildi.
Hücrelerin yaklaşık% 0.4'ü verapamil tedavisinden sonra boyayı dışarı attı, ancak reserpine tedavisinden sonra oran yaklaşık% 0.1'e düştü ve reserpinin bu hücre hattı için daha uygun bir engelleyici olduğunu gösterdi. Bu protokol ayrıca STAT3 aktivatör kolivelin ile tedavi edilen A549 insan akciğer adenokarsinom hücrelerinde ve FRA1 inhibitörü SKLB816 ile tedavi edilen T47D insan meme kanseri hücrelerinde SP hücrelerinin oranını belirlemek için kullanılmıştır. Bu test, sinyal yollarının kanser kök hücrelerinin özellikleri üzerindeki düzenleyici etkisine dair ipuçları sağlar ve sonuçta tümörlerin hedeflenen tedavisine rehberlik edebilecek yeni mekanizmaların keşfini kolaylaştırır.
