Debido a que las bacterias son tan pequeñas, las personas a menudo olvidan que son objetos tridimensionales. Nuestro protocolo permite la reconstrucción precisa de las formas de las células planas y curvas. Este protocolo solo requiere ligeras modificaciones en un microscopio estándar y están disponibles en scripts de MATLAB.
Antes de comenzar el experimento coloque dos pilas de cada uno de tres de 20 por 20 milímetros de cubierta en los extremos opuestos de una sola diapositiva de microscopio de vidrio. Pipetear 200 microlitros de solución de almohadilla de agarosa en el portaobjetos y coloque de forma inmediata y firme una segunda diapositiva sobre la pila de resbalones de cubierta para aplanar la agarosa. Después de permitir que la agarosa se solidifique durante aproximadamente un minuto a temperatura ambiente deslice cuidadosamente la corredera superior y utilice un extremo grande de una punta de pipeta de 200 microlitros para cortar almohadillas individuales de cinco milímetros de diámetro del gel.
Cuando todas las almohadillas se han obtenido pipeta, el cultivo celular de E.coli varias veces para interrumpir cualquier gruma celular y asegurarse de que las células se distribuyen homogéneamente antes de agregar un microlitro de subcultura en cada almohadilla. Después de dejar que las muestras se sequen al aire durante cinco a 10 minutos, confirme que las gotas se han absorbido completamente en las almohadillas antes de colocar un resbalón de cubierta sobre las almohadillas. A continuación, utilice un hisopo de algodón para cepillar suavemente un sellador apropiado alrededor del borde del resbalón de la cubierta, teniendo cuidado de mantener el sellador lejos de la parte superior del resbalón de la cubierta.
Inmediatamente después de sellar el resbalón de la cubierta coloque la diapositiva en una etapa del microscopio y después de cinco minutos de equilibrio térmico utilice las ruedas de enfoque del microscopio para enfocar el centro de una célula. En el software de microscopio asociado en Adquisición de ND, marque la casilla Z para adquirir una pila Z y haga clic en el botón Inicio para establecer el centro de la celda como punto de partida. Establezca el tamaño del paso en 0,1 micrómetros y el rango en cuatro micrómetros y asegúrese de que el dispositivo Z esté configurado en la etapa Piezo.
Es fundamental que haya un desenfoque suficiente en la parte superior e inferior de la celda para que la celda sea casi indistinguible del fondo. Establezca los canales fluorescentes debajo de la ventana lambda en los ajustes de las moléculas fluorescentes que se están buscando y confirme que el orden del experimento se establece en lambda para que se obtenga una pila Z completa en cada canal de color antes de cambiar. A continuación, haga clic en Ejecutar ahora para comenzar la adquisición de imágenes.
Cuando todas las imágenes se han adquirido abrir los archivos en un programa de software de análisis de imágenes adecuado. Dibuje un cuadro alrededor de una celda individual y duplique esa celda dos veces, una para cada canal, asegurándose de que la casilla Duplicar hiperapilación esté marcada y cambie el canal a uno o dos. Una vez que ambas pilas estén disponibles, seleccione Imágenes, Pilas, Herramientas y Concatenar para combinar las imágenes.
Con el canal de proteína primero y el canal de forma segundo. Después de guardar la nueva imagen como un archivo TIFF, haga una carpeta dentro de una carpeta en el escritorio que contenga las imágenes recortadas y el cell_shape_settings_tri. txt de shae-cellshape-public exampleData_tri.
Edite el cell_shape_settings_tri. txt para tener la configuración correcta para el experimento de interés. Y ejecute la función Cell_shape_detector3dConvTriFolder con la cadena a la ubicación de la carpeta seguida del número de la celda en la que se va a iniciar y el número de celdas que se deben ejecutar.
Para confirmar que las celdas se han reconstruido correctamente, ejecute ScreenFits. Cuando se abra la interfaz gráfica de usuario, haga clic en el botón Seleccionar carpeta y seleccione la carpeta con los archivos de datos de reconstrucción para examinar visualmente las reconstrucciones de celdas individuales. Para cualquier celda que parezca deforme o que carezca de cobertura completa, seleccione la casilla situada junto a la reconstrucción para anexar FLAG al nombre para que pueda excluirse de cualquier análisis posterior.
Ejecute enrichmentSmothingSpline para crear un perfil de enriquecimiento de la concentración relativa de la proteína de interés en función de la curvatura gaussiana en la superficie. A continuación, seleccione cada carpeta con el TRI just-created. mat y seleccione el archivo de mat de curva recién creado.
Este método es especialmente útil cuando se trata de celdas curvas o con formas anormales, ya que una representación 2D no puede reflejar la curvatura de las celdas con precisión. En este experimento se generó una proteína de fusión fluorescente verde a la proteína bacteriana de actina MreB para estudiar la localización precisa de la proteína actina tanto en el tipo salvaje como en las células mutantes de E. coli. Al realizar estas mediciones en imágenes capturadas en 3D, las formas del tipo salvaje y las células mutantes rodZosas fueron capaces de ser reconstruidas.
La localización de MreB se determinó entonces para enriquecerse en pequeñas curvaturas gaussianas, una característica geométrica que sólo se puede medir en 3D de una manera dependiente de rodZ. Recuerde asegurarse de que la pila Z es lo suficientemente grande como para que las celdas estén borrosas en la parte superior e inferior y que las celdas estén bien espaciadas unas de otras. Estamos mostrando cómo medir la localización geométrica de proteínas en 3D, pero se puede calcular otra información a partir de estos datos, como el tamaño de los conjuntos de proteínas de etiquetas.
