Este trabajo está financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud, la Fundación Canadiense para la Innovación de la Universidad de Columbia Británica, Centro de Investigación de la Sangre y la Universidad de Columbia Británica del Norte.

1. Preparación de los reactivos <ol><li> Los reactivos que se utilizarán durante todo el experimento debe estar preparado antes de iniciar el protocolo quirúrgico. Tenga en cuenta que todas las soluciones se realizaron utilizando una técnica estéril. </li><li> Solución salina fisiológica (PSS) es el mejor preparado en dos componentes: una solución de sal básica y una solución de bicarbonato de sodio. Preparar dos soluciones a la concentración de 20X y almacenar a 4 ° C. El bicarbonato de sodio a 20X es 360.0mM NaHCO3 (84.01g/mol) y la solución de sal básica en 20 veces la concentración es 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol), 40.0mm de CaCl 2 • 2H 2 O (147.02g/mol), y MgSO 4 • 7H 23.4mm 2 O (246.48g/mol). Las soluciones deben ser preparadas en dH 2 O y los productos químicos hay que añadir uno a la vez y se agita hasta que la solución es clara antes de añadir el producto químico siguiente </li><li> Preparar 2L de PSS mediante la dilución de volúmenes iguales de bicarbonato de sodio y la solución de sal básica y la dilución de la concentración 1X (para dos 2L de PSS diluir 100 ml de cada solución de bicarbonato de sodio y sal básica en dH 2 O </li><li> Lugar matraz aforado de 2 litros que contiene PSS PSS y en 37 ° C baño de agua. Equilibre la solución con 5% de CO 2 / gas balance de nitrógeno durante 1 hora antes de comenzar el procedimiento quirúrgico. </li><li> Sustancias químicas vasoactivas (fenilefrina por ejemplo, la acetilcolina, nitroprusiato de sodio) están mejor preparados a una concentración 1M en dH2O y se almacena en 100μl alícuotas a -20 ° C. </li></ol> 2. Preparación de los animales <ol><li> Determinar el peso del ratón y administrar la dosis inicial de pentobarbital de sodio en 90mg/Kg por inyección intraperitoneal. A lo largo del procedimiento, el ratón es continuamente monitoreado para el plano de anestesia a través de una pizca dedo del pie y un examen cuidadoso de la frecuencia respiratoria. Inyecciones adicionales de pentobarbital de sodio debe ser administrado como sea necesario para mantener a 20mg/kg avión anestesia. El plano quirúrgico de anestesia se mantiene de acuerdo con las regulaciones federales e institucionales tal como se indica en el protocolo de cuidado de los animales aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo (ACUC) de la Universidad de Columbia Británica del Norte. </li><li> Eliminar el vello de la zona abdominal y el flanco / cadera en máquina de afeitar. Suprimir los pelos sueltos de gasa con alcohol y palmaditas en la zona con cinta adhesiva. Esto es suficiente ya que este procedimiento experimental es terminal. </li><li> Coloque el ratón sobre una tabla quirúrgica clara en posición supina y conectar el ratón a la junta con cinta adhesiva de cada pata de la mesa. La temperatura corporal se mantiene a través de una lámpara de calor externa y controlado a través de un termómetro rectal para asegurarse de que la hipotermia no ocurre como resultado de la anestesia. </li></ol> 3. Procedimiento Quirúrgico <ol><li> Durante todo el procedimiento quirúrgico garantizar tejido expuesto se mantiene siempre con una solución equilibrada superfused PSS calentado. También es importante no entrar en contacto con los vasos de interés con los instrumentos quirúrgicos o lesionar los vasos mediante la colocación de mucha fuerza en ellos mediante la manipulación de tejido adiposo y tejido conectivo alrededor de ellos. </li><li> Coloque el ratón en el ámbito de disección. Hacer una incisión a lo largo de la superficie ventral de la cavidad abdominal y retraer la piel hacia la columna vertebral del ratón. </li><li> Una vez que la piel se retrae de manera que la LN es fácilmente visible, el pin de la piel en un pedestal de transparencia Sylgard 184. </li><li> Eliminar la capa delgada de tejido conectivo que cubre los alrededores de la LN </li><li> Desactive la superposición de tejido adiposo y rodean el ganglio linfático hasta el lecho microvascular se expone. El segmento arterial principal establece junto a la LN, y que comúnmente se superpone a la vénula. La cirugía tarda aproximadamente 30 minutos. </li></ol> 4. Análisis de imágenes y de buques <ol><li> Una vez que el segmento de la flota de interés se expone bajo el microscopio de disección, asegurar la preparación en el microscopio intravital. Tenga en cuenta que los restos de animales en el tablero quirúrgico clara, mientras que en el microscopio intravital durante toda la duración del experimento. La temperatura corporal se mantiene a través de una lámpara de calor y se mide a través de un termómetro rectal como se describe en la sección de cirugía. El avión de la anestesia también se controla durante todo el experimento descrito en la sección 2.1. </li><li> Configure la superfusión y las líneas de succión. Superfusión de PSS se produce por gravedad desde un depósito, en el depósito de la chaqueta de agua caliente (la camisa de agua se distribuye y se calienta por el baño de agua circulante) se perfunde en un 5% de CO 2 de nitrógeno equilibrada, y hacia abajo una línea de goteo a una velocidad de 10 ml / min. Una línea de succión debe ser utilizado para continuar tirar PSS superfused lejos de la preparación. Tenga en cuenta que antes de la prueba las líneas de succión y la camisa de agua se limpian y se almacenan después de cada experimento. Esto asegura la esterilidad antes de la siguiente experimento. </li><li> Compruebe la temperatura de la PSS superfusing. Ajuste la temperatura de labaño de agua circulante y / o la tasa de superfusión PSS para alcanzar una temperatura de ~ 37 ° C a través de la preparación. </li><li> Deje que el sistema vascular se equilibre con PSS por lo menos durante 60 minutos y cuantificar el diámetro del vaso con la pinza de vídeo. Por lo general, el diámetro del vaso se debe determinar en varios puntos (por ejemplo, a los 40, 50, y 60 minutos) para asegurar el buque se ha estabilizado. </li><li> Evaluar la salud de los buques que utilicen un agonista del músculo liso específica (por ejemplo fenilefrina, PE) y un agonista específico del endotelio (por ejemplo la acetilcolina, ACh). Concentración de agonista se debe ajustar en función del agonista, pero para el PE y Ach, el buque debe ser evaluado en cada concentración de suma acumulativa (10-5M y 10-9M) a la superfusate. Cada aplicación de agonistas deben estar separadas por una fase de lavado (normalmente 30 minutos) con PSS hasta que el barco vuelve a un diámetro de descanso. </li><li> Tras la evaluación de la salud de los vasos, con posterioridad fármacos vasoactivos, marcaje fluorescente, y la célula de seguimiento experimentos pueden llevarse a cabo. </li><li> Tras el final del experimento los animales se da una sobredosis de pentobarbital sódico. El animal es luego controlada para garantizar que no hay respuesta a pellizcar los dedos y la falta de movimiento respiratorio o latido del corazón. En el momento en que esto es seguido por dislocación cervical. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Tras el período de equilibrio de la preparación debe dar una imagen clara que permita la identificación tanto de las arteriolas y vénulas que los suministros de los ganglios linfáticos inguinales. Debe haber un mínimo de células adiposas que rodean los vasos para permitir las paredes de las arteriolas y vénulas que se observa claramente en las pinzas de vídeo que se superponen para calcular el diámetro del vaso. El punto esencial de una preparación exitosa es la arteriola tiene un rico suministro de sangre se mueve a través de la luz y que hay un grado significativo del tono vascular (es decir, la arteriola tiene la capacidad de vasoconstricción y vasodilatación de músculo liso y endoteliales agonistas específicos, respectivamente) . <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Imagen de microscopía intravital de alimentación linfáticos inguinal nodo arteriola (flecha roja) la alimentación de los ganglios linfáticos se equilibró con solución salina fisiológica y corriendo al lado de la vénula principal (flecha verde). <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Respuesta normal a la fenilefrina superfused vasoactivo (PE) por la suma acumulativa de solución salina fisiológica de las concentraciones de 10 -9 M a 10 -5 M. La presencia de una vasoconstricción robusta es sugerente de la función normal del músculo liso en la arteriola. <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Respuesta normal a la acetilcolina superfused vasoactivo (ACh) por adición acumulativa de solución salina fisiológica de las concentraciones de 10 -9 M a 10 -5 M. La presencia de una vasodilatación robusta sugiere normal presente la función endotelial en la arteriola.

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	<li>Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteriolar+network+architecture+and+vasomotor+function+with+ageing+in+mouse+gluteus+maximus+muscle.">Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle.</a> J Physiol. 561, 535-545 (2004).</li><li>Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+expression+and+conducted+vasodilation+along+arteriolar+endothelium+in+mouse+skeletal+muscle.">Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).</li><li>Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histamine+inhibits+conducted+vasodilation+through+endothelium-derived+NO+production+in+arterioles+of+mouse+skeletal+muscle.">Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle.</a> Faseb J. 18, 280-286 (2004).</li><li>Smeda, J. S., Payne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+autoregulatory+and+myogenic+function+in+the+cerebrovasculature+of+Dahl+salt-sensitive+rats.">Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats.</a> Stroke. 34, 1484-1490 (2003).</li><li>de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+anatomy+of+the+hamster+retractor+muscle+with+regard+to+its+microvascular+transfer.">Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer.</a> Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).</li><li>Domeier, T. L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromechanical+and+pharmacomechanical+signalling+pathways+for+conducted+vasodilatation+along+endothelium+of+hamster+feed+arteries.">Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries.</a> J Physiol. 579, 175-186 (2007).</li></ol>

Microscopia intravital del ganglio linfático inguinal se presenta aquí ofrece la posibilidad de microvasculatura imagen de los ganglios linfáticos en vivo. Por lo tanto, facilita un medio de directa, observación en tiempo real. Imagen de la microvasculatura LN es un sitio único que permite estudiar la relación entre la respuesta inmune y la vasculatura. El uso de este preparado, el enfoque puede ser dirigido específicamente a la respuesta inmunológica, las alteraciones en el sistema vascular, o en la interacción entre los dos. Al igual que con todos los métodos experimentales, la microscopía intravital estándar tiene ventajas y limitaciones. Estándar de IVM, tales como la preparación se describe aquí, se puede modificar fácilmente, y ha sido previamente demostrada por los autores para que la microscopía de epifluorescencia a través de la introducción de colorantes indicador fluorescente o etiquetados poblaciones de células. A pesar de IVM norma no da la posibilidad de imágenes tridimensionales y la localización, como sería dado por microscopía de dos fotones o angiografía, el seguimiento de la célula sigue siendo alcanzado en dos dimensiones, permitiendo la célula a célula y la interacción célula-vascular que se observadas y cuantificadas y, en relación con la administración in vivo y posterior tinción con anticuerpos fluorescentes se pueden utilizar para dar datos sobre la expresión de proteínas / marcador en tiempo real. En particular, técnicas de imagen alternativas requieren un entorno estático para las imágenes; de sujeción de la zona de la cirugía o la adición de un cubreobjetos sobre una preparación plana que se usa frecuentemente. Esto limita, si no elimina, la posibilidad de perfusión activa mediadores vasculares o de otro tipo sobre la preparación para evaluar la integridad vascular y la fisiología, etc, o el uso de otras técnicas tales como experimentos de la vasodilatación a cabo en la preparación de IVM. Además, la norma IVM no requiere una preparación totalmente plano y no se ve afectada por el movimiento, como la generada por la respiración del animal. Esto permite IVM estándar que se utiliza en más áreas quirúrgicas con mayor reproducibilidad. Esto se ejemplifica en la preparación de los ganglios linfáticos inguinales se describe aquí. Dado el tamaño y la forma de los ganglios linfáticos, la preparación no se pueden hacer planos sin dañar el tejido y la localización de los nodos da lugar a movimientos significativos debido a la respiración animal. Estas cuestiones serían difíciles de superar por otros métodos, pero son fáciles de tratar con el uso de la preparación IVM estándar descrito. En resumen, la preparación se detalla más arriba se puede combinar con cualquier número de otros bioquímicos, vasculares y / o técnicas inmunológicas, como la transferencia de los subconjuntos de células activadas o etiqueta, la inducción de la hipoxia y la sobre-expresión de agotamiento de los mediadores vasculares. Sin embargo, otras aplicaciones dependen de la salud de la preparación inicial. Por lo tanto, es vital para probar siempre la salud de la vasculatura se va a examinar y evaluar. Puntos clave para lograr una preparación de la salud se garantiza la preparación es constante perfundidos con PSS equilibrado a la temperatura corporal y minimizar el contacto y la tensión puesta en el área quirúrgica durante la cirugía.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th></tr><tr><td> Bicarbonato de Sodio </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Cloruro de sodio </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Cloruro de Potasio </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Cloruro de calcio dihidrato </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Nitroprusiato de sodio </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Fenilefrina </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Acetilcolina </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Magnesio heptahidratado cloruro </td><td> Sigma Aldrich </td></tr><tr><td> Sodio Pentobarbitol </td><td></td></tr></tbody></table>

intravital microscopy of the inguinal lymph node

Los ganglios linfáticos (LN), que se encuentra en todo el cuerpo, son un componente integral del sistema inmunológico. Sirven como un sitio para la inducción de respuesta inmune adaptativa y, por tanto, el desarrollo de las células efectoras. Como tal, LNS son clave para luchar contra los patógenos invasores y mantener la salud. La elección de la LN para el estudio es dictado por la accesibilidad y el modelo deseado y el ganglio linfático inguinal se encuentra bien y fácilmente compatible con los estudios de modelos biológicamente relevantes de la piel y la infección de las mucosas genitales. El LN inguinal, al igual que todos los LN, tiene una extensa red microvascular dotarlo de sangre. En general, esta red microvascular incluye la arteriola de alimentación principal de la LN que, posteriormente, las ramas y se alimenta vénulas de endotelio alto (HEV). HEV están especializados para facilitar el tráfico de células inmunes en la LN en tanto la homeostasis y la infección. ¿Cómo HEV regular el tráfico en la LN en ambas circunstancias es un área de intensa exploración. El LN alimentar las arteriolas, tiene una influencia directa la corriente en el HEV y es la principal fuente de nutrientes y la sangre rica en células en la LN. Además, los cambios en las arteriolas de alimentación están implicados en la facilitación de la inducción de la respuesta inmune adaptativa. La microvasculatura LN tiene una importancia obvia en el mantenimiento de un óptimo suministro de sangre a la LN y la regulación de flujo de células inmunes en la LN, que son elementos cruciales en la función LN adecuada y la respuesta inmune posteriormente. La capacidad para estudiar la microvasculatura LN en vivo es la clave para esclarecer cómo el sistema inmune y la microvasculatura interactúan y se influyen unos a otros dentro de la LN. A continuación, presentamos un método para imágenes in vivo de los ganglios linfáticos inguinales. Nos centramos en la imagen de la microvasculatura de la LN, prestando especial atención a los métodos que aseguren el estudio de la salud de los vasos, la capacidad de mantener la imagen de los vasos viable en un número de horas, y la cuantificación de la magnitud de los buques. Métodos para la perfusión de la microvasculatura con drogas vasoactivas, así como el potencial de localizar y cuantificar el tráfico celular también se presentan. Microscopia intravital de la LN inguinal permite la evaluación directa de las funciones microvasculares y en tiempo real de la interfaz directa entre las células inmunes, la LN, y la microcirculación. Esta técnica potencial para ser combinado con técnicas inmunológicas muchos y etiquetado de células fluorescentes, así como manipular a estudiar la vasculatura de LN otros.

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Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Una técnica para la realización de microscopía intravital del ganglio linfático inguinal (LN) se describe. Dicha técnica permite en tiempo real,<em&gt; In vivo</em&gt; Estudio de la microvasculatura de los ganglios linfáticos y la estructura tanto en la homeostasis y la infección. Esta técnica se puede adaptar a los estudios de tráfico celular y otros sitios de ganglios linfáticos.

Microscopia intravital de los ganglios linfáticos inguinales

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

intravital-microscopy-of-the-inguinal-lymph-node

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.9K vistas.  University of Northern British Columbia. Una técnica para la realización de microscopía intravital del ganglio linfático inguinal (LN) se describe. Dicha técnica permite en tiempo real, In vivo Estudio de la microvasculatura de los ganglios linfáticos y la estructura tanto en la homeostasis y la infección. Esta técnica se puede adaptar a los estudios de tráfico celular y otros sitios de ganglios linfáticos.

Video: Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Ex vivo de imágenes de células T en los ganglios linfáticos murino Rebanadas con campo amplio y microscopios confocal

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Investigación

Inmunología e Infección

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Murino linfáticos superficiales Cirugía de los ganglios

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imagen intravital del timo de ratón utilizando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Microscopia intravital del bazo: Análisis cuantitativo de la movilidad del parásito y el flujo sanguíneo

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Imagen intravital del nodo linfático poplíteo ratón

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

Generación de nódulos linfáticos de grasa Pad quimeras para el Estudio del Ganglio Linfático estroma origen de célula

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Aislamiento de células estromales murinas en nódulos linfáticos

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

Microscopia intravital de imágenes del hígado después<em&gt; Leishmania</em&gt; Infección: Una Evaluación de Hemodinámica hepática

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

Recogida y tratamiento de los ganglios linfáticos de animales grandes para el análisis de ARN: preparación para estudios de nodo de linfa transcriptómicos de grandes especies animales

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...