Este protocolo utiliza un microscopio multifiltro para la toma de imágenes en vivo de toda la estructura de la superficie ocular del ratón en el modelo de ratón transgénico fluorescente dual. La combinación de una plataforma microscópica multifoto personalizada y ratones transgénicos fluorescentes duales permite la visualización en tiempo real de la estructura y la estructura de la superficie ocular. Para configurar el microscopio multifoto, seleccione el objetivo de inmersión de agua 20X, 1.00 NA y configure el láser Titanium Sapphire como fuente de excitación en un microscopio vertical.
Establezca la longitud de onda de salida láser en 880 nanómetros para EGFP y 940 nanómetros para tdTomato. Incluya dos espejos dicroicos para la separación de los filtros de paso de banda SHG EGFP y EGFP tdTomato y utilice filtros de paso de banda de 434-17, 510-84 y 585-40 nanómetros para separar espectralmente las señales EGFP y tdTomato. Para configurar el portacuchillas, después de confirmar la falta de respuesta al reflejo del pedal en un ratón anestesado de 8-12 semanas de edad, coloque el ratón en la etapa del microscopio calentado e inserte una sonda de monitoreo de temperatura.
Coloque el ratón en un soporte de ratón estereotaxico personalizado e inserte las barras de los oídos en el carnoso auditivo externo. Utilice una fijación de tres puntos para fijar el soporte de la cabeza y aplicar un clorhidrato de oxibuprocaína al 0,4%y solución salina a la superficie ocular. Cubra las puntas de un par de fórceps Dumont número cinco con el lazo de tubo PE.
Después de tres minutos realizar una retracción manual del párpado para confirmar la protrusión del globo ocular y colocar cuidadosamente un lazo de tubo del soporte de PE a lo largo del margen del párpado para exponer la superficie ocular. Y utilice la perilla del soporte para estabilizar el globo ocular con los fórceps. A continuación, cubra la superficie corneal con un gel para los ojos con un índice de refracción de 1.338.
Para la toma de imágenes en serie Z de la superficie corneal, utilice una fuente de luz de mercurio para tomar imágenes del campo de orientación y abrir el software del microscopio. Seleccione el multiplicador de fotos adecuado y las ganancias digitales para visualizar la estructura celular en la superficie ocular y establezca la primera y la última diapositiva para permitir la adquisición de una pila de imágenes. Establezca la resolución de la imagen en 512 por 512 píxeles y el paso Z en un micrómetro.
A continuación, haga clic en comenzar para recopilar imágenes serie Z que adquieran una imagen en vivo con una excitación de 880 nanómetros para la colección de señales SHG EGFP, y una imagen en vivo en una excitación de 940 nanómetros para la recopilación de señales EGFP tdTomato dentro de cada área. A lo largo de la imagen, utilice el soporte de etapa motorizado paso a paso para girar el globo ocular para permitir la toma de imágenes a través de toda la superficie corneal. Cuando se hayan adquirido todas las imágenes, cargue las imágenes serie Z en Fiji y seleccione el complemento de filtro Median 3D.
Después de eliminar el ruido de fondo, seleccione el paquete de filtro de máscara desenfocada Fiji para afilar las imágenes y haga clic en contraste de brillo automático para optimizar automáticamente la calidad de las imágenes. Después del procesamiento, guarde las imágenes como una secuencia de imágenes en serie y exporte la secuencia de imágenes en un programa de software de reconstrucción 3D adecuado. En todas las imágenes de microscopía multifoto, presente las señales EGFP tdTomato y SHG en pseudo verde, rojo y cian respectivamente antes de capturar las imágenes de estructura 3D por instantánea.
La microscopía multifotogénica permite la visualización de células superficiales Wing y Basal en el epitelio corneal de ratones transgénicos fluorescentes duales. Las células individuales de la capa basal se pueden asignar a la capa superficial, así como a células superficiales de forma hexagonal única. Como revela la expresión citoplasmática de la señal tdTomato, el sistema vesicular intracelular rico en proteínas de membrana, incluyendo el aparato golgi y el retículo endoplasmático está disperso dentro de las células del ala.
Dentro del estroma colágenoso, los corates en forma de estelar son esbozados por la membrana dirigida a los fluorescentes EGFP en estos ratones. Los corates incrustados en el estroma universitario están más sueltos espaciados que dentro de las células endoteliales. Además, los nervios ramificados delgados dentro del estroma corneal también se pueden visualizar mediante la membrana dirigida a las señales tdTomato y las monocapas de células endoteliales corneales demuestran una forma hexagonal relativamente homogénea conectada en un patrón de panal.
El epitelio limbal consta de una a dos capas de células epiteliales. La cepa transgénica de reportero fluorescente dual también permite la toma de imágenes de capilares dentro de la conjuntiva, facilitando la reconstrucción de la arquitectura 3D de los capilares que delinean el endotelio vascular. Estabilizar el globo ocular con presión moderada sin lesiones es fundamental para adquirir imágenes de buena calidad, ya que una presión insuficiente o excesiva puede comprometer la calidad de la imagen.
Esta plataforma de imágenes de imágenes NVivo se puede modificar para la visualización de estructuras debajo de la superficie ocular y se puede aplicar a estudios in situ de diversas enfermedades oftálmicas.
