Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R01GM080376, R35GM118139 de los NISF y el Centro de Mecanobiología de Ingeniería CMMI: 15-48571 a Y.E.G., y por una beca predoctoral nrsa del NIAID F30AI114187 a R.M.J.

NOTA: Todos los pasos se pueden completar en el espacio de laboratorio general.
1. Limpieza de cubrebocas de vidrio
<ol><li>Para proporcionar una superficie limpia para la deposición evaporativa de partículas coloidales, coloque 24 x 30 mm de tapas de vidrio de borosilicato óptico (0,16−0,19 mm de espesor) dentro de las inserciones acanaladas de un frasco de tinción de vidrio coplin para su limpieza. NOTA: Asegúrese de que las tapas estén erguidas y bien separadas para que todas las superficies estén claramente expuestas durante el proceso de limpieza.</li>
	<li>Vierta suficiente acetona en el frasco de tinción para cubrir las cubiertas, coloque la cubierta y sonice durante 10 minutos a 40 ° C.</li>
	<li>Vierta la acetona y enjuague las tapas llenando el frasco de tinción con H2O destilado y vertiendo el agua. Repita 2 veces más.</li>
	<li>Repita la sonicación de acetona (pasos 1.2 y 1.3) una vez más.</li>
	<li>Vierta suficiente KOH de 200 mM en el frasco para cubrir los cubrebocas y sonicar, cubierto, durante 20 minutos a 40 ° C. NOTA: El KOH graba ligeramente el vidrio.</li>
	<li>Enjuague los cubrebocas con H2O destilado 6 veces.</li>
	<li>Agregue etanol para cubrir las cubiertas, agregue la tapa y sonice durante 10 minutos a 40 ° C.</li>
	<li>Enjuague los cubrebocas con H2O 3 veces destilado.</li>
	<li>Recoja cada cubrebocas en el borde usando pórceps suaves y seque las cubiertas con gas N2. Toque sólo los bordes de la cubierta. Coloque cada uno de los cubrebocas secos y limpios en una placa de Petri limpia individual.</li>
</ol>2. Deposición evaporativa de perlas de poliestireno
<ol><li>Para crear la máscara de cristal coloidal para la matriz ZMW, centrífuga 50 μL de 1 μm de diámetro, perlas de poliestireno no funcionalizadas (2,5% p/v en agua) a 15.000 x g,25 °C durante 5 min. NOTA: Antes de pipetear las perlas, la solución común debe ser brevemente vórtice en caso de que las cuentas se hayan asentado en el fondo de la botella.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante, dejando la menor agua restante posible. NOTA: El agua residual puede cambiar las propiedades de evaporación de la resuspensión de etanol39,por lo que la eliminación de una pequeña cantidad de perlas para eliminar toda el agua es aceptable.</li>
	<li>Resuspend las cuentas del paso 2.2 en 50 μL de 1:400 TritonX-100:solvente de etanol. Pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar a fondo las cuentas con el disolvente. NOTA: TritonX-100: el disolvente de etanol debe sellado con película de parafina después de su uso y prepararse fresco una vez al mes. Las cuentas tienden a adherirse a los lados de un recipiente de plástico, como un tubo de microcentrífuga, por lo que la pipeta a lo largo de los lados para asegurarse de que todas las cuentas se resuspended.</li>
	<li>Para configurar una cámara de humedad para la deposición, coloque 6 placas de Petri, cada una con un cubrebocas, en un banco en una línea con tapas ligeramente entreabiertas. En cada plato, mueva el cubrebocas a la región abierta para que los cubrebocas se expongan al ambiente cuando la humedad aumente en el siguiente paso.</li>
	<li>Coloque un higrómetro y un pequeño ventilador eléctrico centrado detrás de las placas de Petri.</li>
	<li>Registre la humedad relativa inicial (RH) en el laboratorio. Llene un beaker de 200 mL con 150−200 mL de agua de ~75 °C y colóquelo detrás del ventilador.</li>
	<li>Encienda el ventilador y cubra las placas de Petri, el ventilador, el casto y el higrómetro con un recipiente de almacenamiento de plástico transparente y volcado (66 cm x 46 cm x 38 cm).</li>
	<li>Deje que el DERECHO en la cámara se eleve a 70−75%, lo que típicamente toma 5−10 min. NOTA: Si el RH del laboratorio ambiental es bajo (por debajo de ~ 50%), deje que la cámara alcance un RH más alto, pero no superior al 80%, para compensar la pérdida de humedad durante la deposición (ver más abajo).</li>
	<li>Cuando el RH alcance el 70−75%, registre el RH y levante ligeramente el recipiente de almacenamiento de plástico para colocar rápidamente las cubiertas en las placas de Petri, lo que evita la humectación excesiva de los cubrebocas. NOTA: La temperatura en la cámara será ligeramente más cálida que la temperatura ambiente, típicamente 25−26 °C, como resultado de la humidificación. Si la humedad es visible en las cubiertaslipos, entonces las superficies de vidrio están demasiado húmedas. Una guantera comercial podría simplificar esta parte del protocolo.</li>
	<li>Que el RH en la cámara siga subiendo hasta el 85%. En ese momento, registre el RH en la cámara de humedad y la pipeta 5 μL de la suspensión de perlas en el centro de cada cubrebocas.</li>
	<li>Cierre la cámara y las placas de Petri después de cada deposición para minimizar la pérdida de humedad. Trate de terminar las 6 deposiciones dentro de 2 min.</li>
	<li>Registre el RH en la cámara después de la deposición. NOTA: El RH después de la deposición ayudará a medir la rapidez con la que se perdió la humedad durante la deposición, lo que depende de las condiciones ambientales del laboratorio. Para una ejecución típicamente exitosa, la cámara comenzará en 85% HR antes de la deposición y terminará en 70−75% RH después de la deposición.</li>
	<li>Deje que las gotas de cuentas se extiendan y se sequen durante 5 min. NOTA: Si los cristales coloidales tienen muchos agujeros o regiones de varias capas, entonces la cámara era probablemente demasiado húmeda o seca, respectivamente. Ajuste la humedad relativa a la que cerrar las placas de Petri y comience las deposiciones (consulte la sección de resultados para obtener más información sobre la optimización).</li>
</ol>3. Recocido de cuentas para reducir el tamaño de los poros en la plantilla de cristal coloidal
<ol><li>Para proporcionar una superficie de temperatura uniforme para el recocido de las perlas de poliestireno, que estrecha los intercondidos de las inter-perlas y redondea las esquinas de los interstices, coloque una placa de aluminio plana y fresada en la parte superior de una placa caliente de cerámica estándar.</li>
	<li>Ajuste la temperatura de la placa caliente a 107 °C, la temperatura de transición vítrea de poliestireno40. NOTA: Para obtener una temperatura estable y precisa, se mantuvo una sonda de termopar en un agujero de 2−3 mm de ancho y 4−5 mm de profundidad en la placa de aluminio.</li>
	<li>Coloque un cubrebocas que contenga la plantilla de perlas en la placa de aluminio caliente y el recocido durante 20 s (consulte la sección de discusión para obtener una explicación del tiempo de fusión).</li>
	<li>Después de calentar, retire el cubrebocas de la placa de aluminio y colócalo rápidamente en otra superficie de aluminio a temperatura ambiente para enfriarlo. NOTA: Es útil hacer que las cubiertas cuelguen ligeramente sobre el borde de la placa o fresar canales poco profundos (ver el video que lo acompaña) en la placa para facilitar la recogida de las cubiertas.</li>
</ol>4. Nanofabricación de guías de onda de modo cero de aluminio utilizando la plantilla de cristal coloidal
<ol><li>Usando la deposición evaporativa térmica o de haz de electrones, deposite 300 nm de cobre a 2 Å/s sobre la plantilla de cristal coloidal para generar postes en los interstices entre las perlas.</li>
	<li>Retire el exceso de metal en la parte superior de las cuentas presionando suavemente la superficie con cinta adhesiva. Pelar lentamente la cinta para sacar el metal. NOTA: Algunos pequeños parches de exceso de metal reflectante pueden permanecer después de la extracción de la cinta, y estos a menudo pueden ser eliminados por una corriente de gas N2. Si quedan parches sustanciales de exceso de metal reflectante después de la extracción de la cinta, intente remojar las plantillas en tolueno durante 2 h para disolver parcialmente las perlas de poliestireno. Lavar las tapas con agua destilada, secar conN2, y repetir la cinta tire. El remojo adicional no debe disolver completamente las cuentas, ya que las cuentas ayudan a proteger los postes de daños durante la extracción de la cinta.</li>
	<li>Para disolver las cuentas de poliestireno, coloque las plantillas de cuentas en tolueno y remoje durante la noche. PRECAUCIÓN: Los humos de tolueno pueden ser tóxicos. Trabaje con tolueno bajo una capucha bien ventilada y use equipo de protección personal, incluidos guantes, anteojos de seguridad y una bata de laboratorio. El tolueno debe almacenarse en armarios ventilados designados para líquidos inflamables.</li>
	<li>Después de la incubación de tolueno, enjuague las plantillas una vez con cloroformo y dos veces con etanol. Maneje los cubrebocas con cuidado en este punto porque los delicados postes de metal de 200-300 nm de altura ahora están expuestos. Seque las plantillas con N2 y elimine elpolímero residual y los contaminantes en un limpiador de plasma de oxígeno durante 30 min. PRECAUCIÓN: Los humos de cloroformo pueden ser tóxicos. Trabaje con cloroformo bajo una capucha bien ventilada y use equipo de protección personal, incluidos guantes, gafas de seguridad y una bata de laboratorio. El cloroformo debe almacenarse en armarios ventilados lejos de otros disolventes inflamables.</li>
	<li>Usando deposición evaporativa térmica o de haz de electrones, deposite 3 nm de una capa de adhesión de titanio a 1 Å/s seguida de 100−150 nm de aluminio a 4 Å/s alrededor y encima de los postes de cobre. NOTA: Uno puede usar un revestimiento más grueso para obtener guías más profundas y una mejor atenuación de la fluorescencia de fondo, pero esto también disminuye el rendimiento después de exponer y disolver los postes en el siguiente paso (consulte la sección de discusión).</li>
	<li>Para disolver los postes metálicos, remoje las cubiertas en grabador de cobre (a base de ácido cítrico; Tabla de Materiales) para 2 h. PRECAUCIÓN: El grabador de metal puede causar quemaduras en la piel. Trabaje con grabados bajo una capucha bien ventilada y use equipo de protección. Lávese bien las manos después de manipular. El grabador metálico debe almacenarse en armarios ventilados designados para líquidos corrosivos.</li>
	<li>Enjuague los cubrebocas con agua destilada, seque con N2,y enjuague suavemente la superficie del revestimiento metálico con papel de lente para exponer cualquier poste que todavía esté cubierto de revestimiento. Coloque las tapas de nuevo en grabador de cobre durante otras 2 h, luego enjuague de nuevo con agua destilada y seque conN2. NOTA: Las diapositivas ZMW deben almacenarse en placas de Petri cubiertas y limpias para mantenerlas libres de contaminantes.</li>
</ol>5. Nanofabricación de guías de onda de modo cero de oro utilizando la plantilla de cristal coloidal
NOTA: El método para fabricar ZMWs de oro(Figura suplementaria 1),que refleja el protocolo para fabricar ZMWs de aluminio, se proporciona en esta sección.
<ol><li>Utilizando la deposición evaporativa térmica o de haz de electrones, deposite 3 nm de una capa de adhesión de titanio a 1 Å/s seguida de 300 nm de aluminio a 4 Å/s.</li>
	<li>Retire el exceso de metal en la parte superior de las cuentas presionando suavemente la superficie con cinta adhesiva. Pelar lentamente la cinta para sacar el metal.</li>
	<li>Para disolver las cuentas de poliestireno, coloque las plantillas de cuentas en tolueno y remoje durante la noche.</li>
	<li>Después de la incubación de tolueno, enjuague las plantillas una vez con cloroformo y dos veces con etanol. Seque las plantillas conN2 y elimine los contaminantes poliméricos residuales en un limpiador de plasma de oxígeno durante 30 min.</li>
	<li>Utilizando la deposición evaporativa térmica o de haz de electrones, deposite 100−150 nm de oro a 5 Å/s alrededor y encima de los postes de aluminio.</li>
	<li>Para disolver los postes metálicos, remoje las cubiertas en grabador de aluminio (a base de ácido fosfórico; Tabla de Materiales) para 1 h.</li>
	<li>Enjuague los cubrebocas con agua destilada, seque con N2,y enjuague suavemente la superficie del revestimiento metálico con papel de lente para exponer cualquier poste que todavía esté cubierto de revestimiento. Coloque las tapas de nuevo en grabador de aluminio durante 1 h, luego enjuague de nuevo con agua destilada y seque con N2. NOTA: Las diapositivas ZMW deben almacenarse en placas de Petri cubiertas y limpias.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para el autoensamblaje coloidal (sección de protocolo 2), el uso de etanol en lugar de agua como disolvente de suspensión acelera el proceso de evaporación para que las plantillas estén listas en 2−3 min después de la deposición en lugar de 1−2 h como en los métodos anteriores48,49. El protocolo de sedimentación evaporativa presentado aquí también es más simple que los protocolos de sedimentación anteriores que requieren controlar la inclinación ...

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Figure 3 was updated from:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

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Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Las técnicas de molécula única como la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de molécula única (smFRET) o la espectroscopia de correlación de fluorescencia de molécula única (FCS) son herramientas poderosas para la biofísica molecular, permitiendo el estudio de movimientos dinámicos, conformaciones e interacciones de biomoléculas individuales en procesos como la transcripción1,2,3,traducción4,5,6,y muchos otros7. Para smFRET, la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) es un método común porque muchas moléculas atados pueden seguirse con el tiempo, y la onda evanescente generada por TIR se limita a una región de 100−200 nm adyacente a la cubierta8. Sin embargo, incluso con esta restricción en el volumen de excitación, los fluoróforos de interés todavía necesitan ser diluidos a rangos de pM o nM para detectar señales de una sola molécula por encima de la fluorecencia de fondo9. Dado que las constantes de Michaelis-Menten de las enzimas celulares están típicamente en el rango de μM a mM10,las reacciones bioquímicas en los estudios de moléculas individuales suelen ser mucho más lentas que las de la célula. Por ejemplo, la síntesis de proteínas ocurre a 15−20 aminoácidos por segundo en E. coli11,12,mientras que la mayoría de los ribosomas procariotas en experimentos smFRET se traducen a 0,1−1 aminoácidos por segundo13. En la síntesis de proteínas, las estructuras cristalinas y smFRET en ribosomas estancados mostraron que los ARN de transferencia (ARNt) fluctúan entre los estados 'híbrido' y 'clásico' antes de la etapa de translocación de ARNt-ARNm14,15. Sin embargo, cuando las concentraciones fisiológicas del factor de translocación GTPasa, EF-G, estuvo presente, se observó una conformación diferente, intermedia entre los estados híbrido y clásico, en smFRET6. El estudio de procesos moleculares dinámicos a tasas y concentraciones similares a las de la célula es importante, pero sigue siendo un desafío técnico.
Una estrategia para aumentar la concentración de sustrato fluorescente es el uso de aperturas de longitud de onda sub-visibles basadas en metal, llamadas guías de onda de modo cero (ZMWs), para generar campos de excitación confinados que excitan selectivamente las biomoléculas localizadas dentro de las aperturas16 (Figura 1). Las aperturas son típicamente 100−200 nm de diámetro y 100−150 nm de profundidad17. Por encima de una longitud de onda de corte relacionada con el tamaño y la forma de los pozos (λc ≈ 2,3 veces el diámetro para las guías de onda circulares con agua como el medio dieléctrico18),no se permiten modos de propagación en la guía de onda, de ahí el término guías de onda de modo cero. Sin embargo, un campo electromagnético oscilante, denominado onda evanescente, que decae exponencialmente en intensidad todavía hace túneles a corta distancia en la guía de onda18,19. Aunque son similares a las ondas evanescentes TIR, las ondas evanescentes ZMW tienen una constante de decaimiento más corta, lo que resulta en una región de excitación efectiva de 10−30 nm dentro de la guía de onda. En las concentraciones micromolares de ligands fluorescente etiquetados, solamente una o algunas moléculas están simultáneamente presentes dentro de la región de la excitación. Esta restricción del volumen de excitación y la consiguiente reducción de la fluorescencia de fondo permite la obtención de imágenes de fluorescencia de moléculas individuales a concentraciones biológicamente relevantes. Esto se ha aplicado a muchos sistemas20,incluyendo mediciones fcs de difusión de proteína única21,mediciones fret de molécula única de ligando de bajaafinidad-proteína 22 e interacciones proteína-proteína23,y mediciones espectro-electroquímicas de eventos de recambio molecular único24.
Los ZMWs se han producido modelando directamente una capa metálica utilizando fresado de haz de iones25,26 o litografía de haz de electrones (EBL) seguida de grabado por plasma16,27. Estos métodos de litografía sin máscara crean guías de onda en serie y normalmente requieren acceso a instalaciones especializadas de nanofabricación, lo que impide la adopción generalizada de la tecnología ZMW. Otro método, la litografía ultravioleta nanoimprint lift-off28, utiliza un molde de deslizamiento de cuarzo para presionar una plantilla ZMW inversa sobre una película de resistencia como un sello. Si bien este método es más simplificado, todavía requiere EBL para la fabricación del molde de cuarzo. Este artículo presenta el protocolo para un método de fabricación con plantilla simple y económico que no requiere EBL o fresado de haz de iones y se basa en el cierre de embalaje de nanoesferas para formar una máscara litográfica.
La nanoesfera o litografía "natural", que fue propuesta por primera vez en 1982 por Deckman y Dunsmuir29,30,utiliza el autoensamblaje de partículas coloidales monodisperse, que van desde decenas de nanómetros hasta decenas de micrómetros31,para crear plantillas para el modelado de superficies a través de grabado y / o deposición de materiales. Las matrices periódicas extendidas bidimensionales (2D) o tridimensionales (3D) de partículas coloidales, denominadas cristales coloidales, se caracterizan por una iridiscencia brillante de dispersión y difracción32. Aunque se utiliza menos que el haz de electrones o la fotolitografía, esta metodología de enmascaramiento es simple, de bajo costo y se reduce fácilmente para crear tamaños de entidad por debajo de 100 nm.
Dirigir el autoensamblaje de partículas coloidales determina el éxito del uso de cristales coloidales como máscaras para el modelado de superficies. Si el tamaño y la forma de las partículas son homogéneos, las partículas coloidales pueden autoensamblarse fácilmente con empaquetamiento hexagonal, impulsado por el agotamiento entrómico33. La evaporación del agua después del recubrimiento de gota es una ruta efectiva para sedimentar las partículas coloidales, aunque otros métodos incluyen el recubrimiento por inmersión34,el recubrimiento de espín35,la deposición electroforética36y la consolidación en una interfaz aire-agua37. El protocolo que se presenta a continuación se basa en el método de sedimentación por evaporación, que fue el más sencillo de implementar. Los intertices triangulares entre perlas de poliestireno empaquetadas de cerca forman aberturas en las que platear un metal de sacrificio, formando postes (Figura 2 y Figura suplementaria 1). El breve recocido de las cuentas antes de este paso ajusta la forma y el diámetro de estos postes. Se retiran las cuentas, se deposita una capa de metal final alrededor de los postes y luego se retiran los postes. Después de que los dos pasos de deposición de metal en la nanomáscara coloidal, la eliminación de los postes intermedios, y la modificación de la química de la superficie para la pasivación y el atado, matrices ZMW están listas para su uso para la obtención de imágenes de una sola molécula. Una caracterización más extensa de las propiedades ópticas de ZMW después de la fabricación se puede encontrar en un artículoadjunto 38. Además de un evaporador térmico para la deposición de vapor de los metales, no se requieren herramientas especializadas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:667px;" width="668">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1. Glass Coverslip Cleaning</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Acetone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coplin glass staining jar</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-817</td>
			<td>Staining jar with 8 grooves and molded glass cover</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:103px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48404-467</td>
			<td>24 mm x 30 mm (No.1&#189;, Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">KOH</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R80115TS</td>
			<td>100 mm diameter, 15 mm deep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sonicator</td>
			<td style="width:103px;">Branson</td>
			<td style="width:119px;">Z245143</td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 5510</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Clear storage container</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-110-8222</td>
			<td>26 x 18 x 15 in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Desk fan</td>
			<td style="width:103px;">O2Cool</td>
			<td style="width:119px;">FD05001A</td>
			<td>Any small desk (~5 in.) fan will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glass beaker</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-555-25B</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Humidity meter</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-661-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21-402-903</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polystyrene microspheres</td>
			<td style="width:103px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">18602-15</td>
			<td>1.00 &#181;m diameter, non-functionalized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X-100 deturgent</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Aluminum plate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AA11062RY</td>
			<td>Customized in-house to 14 cm x 14 cm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Ceramic hotplate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">HP88857100</td>
			<td>13 x 8.2 x 3.8 in.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">38615K71</td>
			<td>Read temperature with thermocouple probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thermocouple probe</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">9251T93</td>
			<td>Type K, surface probe</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">Type A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAL40QXHB</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Chloroform</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">49-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMCU40QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gold pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAUXX40G</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lens paper</td>
			<td style="width:103px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:103px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:119px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:103px;">Staples</td>
			<td style="width:119px;">MMM119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Thin film deposition system</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">PVD-75</td>
			<td>Tabletop thermal evaporation system will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Titanium pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMTI45QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Toluene</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">244511</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Representative Results</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">COMSOL Multiphysics Modeling Software</td>
			<td>COMSOL, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dual View spectral splitter</td>
			<td style="width:103px;">Photometrics, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy

En la enzimología de fluorescencia de molécula única, la fluorescencia de fondo de sustratos etiquetados en solución a menudo limita la concentración de fluoróforos a rangos pico- a nanomolares, varios órdenes de magnitud menos que muchas concentraciones fisiológicas de ligandos. Las nanoestructuras ópticas llamadas guías de onda de modo cero (ZMWs), que son aperturas de 100−200 nm de diámetro fabricadas en un metal conductor delgado como el aluminio o el oro, permiten obtener imágenes de moléculas individuales a concentraciones micromolares de fluoróforos al limitar la excitación de la luz visible a volúmenes efectivos de zeptolitros. Sin embargo, la necesidad de equipos de nanofabricación costosos y especializados ha impedido el uso generalizado de ZMWs. Por lo general, las nanoestructuras como ZMWs se obtienen por escritura directa utilizando litografía de haz de electrones, que es secuencial y lenta. Aquí, la litografía coloidal o nanoesfera se utiliza como una estrategia alternativa para crear máscaras a escala nanométrica para la fabricación de guías de onda. Este informe describe el enfoque en detalle, con consideraciones prácticas para cada fase. El método permite que miles de ZMWs de aluminio u oro se hagan en paralelo, con diámetros de guía de onda finales y profundidades de 100−200 nm. Solo se requiere un equipo de laboratorio común y un evaporador térmico para la deposición de metales. Al hacer que los ZMWs sean más accesibles para la comunidad bioquímica, este método puede facilitar el estudio de los procesos moleculares a concentraciones y tasas celulares.

El autoensamblaje de las partículas coloidales de poliestireno a través de la sedimentación evaporativa (pasos 2.1−2.13) puede producir una gama de resultados ya que requiere el control de la tasa de evaporación del disolvente. Sin embargo, debido a que las deposiciones son rápidas (10−15 min por ronda), el procedimiento se puede optimizar rápidamente para diferentes condiciones ambientales de laboratorio. La Figura 3A muestra una plantilla coloidal bien formada después de la depo...

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Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Aquí se describe un método de litografía de la nanoesfera para la fabricación paralela de guías de onda de modo cero, que son matrices de nanoaperturas en un cubrebocas de microscopía de vidrio revestido de metal para imágenes de una sola molécula en concentraciones nano a micromolar de fluoróforos. El método aprovecha el autoensamblaje de cristal coloidal para crear una plantilla de guía de onda.

Fabricación de guías de onda de modo cero para microscopía de molécula única de alta concentración

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

fabrication-zero-mode-waveguides-for-high-concentration-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.8K vistas.  University of Pennsylvania. Aquí se describe un método de litografía de la nanoesfera para la fabricación paralela de guías de onda de modo cero, que son matrices de nanoaperturas en un cubrebocas de microscopía de vidrio revestido de metal para imágenes de una sola molécula en concentraciones nano a micromolar de fluoróforos. El método aprovecha el autoensamblaje de cristal coloidal para crear una plantilla de guía de onda.

Video: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

Bajo Costo Cryo-microscopio de luz para la luz de la etapa de fabricación correlacionadas / Microscopía Electrónica

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Investigación

Bioingeniería

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplexado de una sola molécula de mediciones de la Fuerza proteólisis utilizando pinzas magnéticas

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Fabrication of Carbon Nanotube High-Frequency Nanoelectronic Biosensor for Sensing in High Ionic Strength Solutions

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them good candidates for high sensitivity biosensors. When a charged molecule binds to such a sensor surface, it alters the carrier density5 in the sensor, resulting in changes in its DC conductance. However, in an ionic solution a charged surface also attracts counter-ions from the solution, forming an electrical double layer (EDL). This EDL effectively screens off the charge, and in physiologically relevant conditions ~100 millimolar (mM), the characteristic charge screening length (Debye length) is less than a nanometer (nm). Thus, in high ionic strength solutions, charge based (DC) detection is fundamentally impeded6-8.
We overcome charge screening effects by detecting molecular dipoles rather than charges at high frequency, by operating carbon nanotube field effect transistors as high frequency mixers9-11. At high frequencies, the AC drive force can no longer overcome the solution drag and the ions in solution do not have sufficient time to form the EDL. Further, frequency mixing technique allows us to operate at frequencies high enough to overcome ionic screening, and yet detect the sensing signals at lower frequencies11-12. Also, the high transconductance of SWNT transistors provides an internal gain for the sensing signal, which obviates the need for external signal amplifier.
Here, we describe the protocol to (a) fabricate SWNT transistors, (b) functionalize biomolecules to the nanotube13, (c) design and stamp a poly-dimethylsiloxane (PDMS) micro-fluidic chamber14 onto the device, and (d) carry out high frequency sensing in different ionic strength solutions11.

We describe the device fabrication and measurement protocol for carbon nanotube based high frequency biosensors. The high frequency sensing technique mitigates the fundamental ionic (Debye) screening effect and allows nanotube biosensor to be operated in high ionic strength solutions where conventional electronic biosensors fail. Our technology provides a unique platform for point-of-care (POC) electronic biosensors operating in physiologically relevant conditions.

La fabricación de nanotubos de carbono de alta frecuencia Nanoelectrónica biosensor para la detección in High Solutions fuerza iónica

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using sonication, mechanical agitation, microfluidic devices, or homogenization. Recently, lipid-based oxygen microbubbles (LOMs) have been designed to deliver oxygen intravenously during medical emergencies, reversing life-threatening hypoxemia, and preventing subsequent organ injury, cardiac arrest, and death. We present methods for scaled-up production of highly oxygenated microbubbles using a closed-loop high-shear homogenizer. The process can produce 2 L of concentrated LOMs (90% by volume) in 90 min. Resulting bubbles have a mean diameter of ~2 &#956;m, and a rheologic profile consistent with that of blood when diluted to 60 volume %. This technique produces LOMs in high capacity and with high oxygen purity, suggesting that this technique may be useful for translational research labs.

We describe methods for the manufacture of large volumes of lipid-based oxygen microbubbles (LOMs) designed for intravenous oxygen delivery using high-shear homogenization and serial concentration.

Fabricación de concentrado, de oxígeno a base de lípidos microburbujas Emulsiones por High Shear Homogeneización y Concentración de serie

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Individual Detección Molecule-Label gratis con Microtoroid ópticos Resonadores

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic resonance (MR) microscopy data. While it is possible to perform MR collections on living, excised mammalian tissue, such experiments have traditionally been constrained by resolution limits and are thus incapable of visualizing tissue microstructure. Conversely, MR protocols that did achieve microscopic image resolution required the use of fixed samples to accommodate the need for static, unchanging conditions over lengthy scan times. The current protocol describes the first available MR technique that enables imaging of living, mammalian tissue samples at microscopic resolutions. Such data is of great importance to the understanding of how pathology-based contrast changes occurring at the microscopic level influence the content of macroscopic MR scans such as those used in the clinic. Once such an understanding is realized, diagnostic methods with greater sensitivity and accuracy can be developed, which will translate directly to earlier disease treatment, more accurate therapy monitoring and improved patient outcomes.
While the described methodology focuses on brain slice preparations, the protocol is adaptable to any excised tissue slice given that changes are made to the gas and perfusate preparations to accommodate the tissue&#39;s specific metabolic needs. Successful execution of the protocol should result in living, acute slice preparations that exhibit MR diffusion signal stability for periods up to 15.5 h. The primary advantages of the current system over other MR compatible perfusion apparatuses are its compatibility with the MR microscopy hardware required to attain higher resolution images and ability to provide constant, uninterrupted flow with carefully regulated perfusate conditions. Reduced sample throughput is a consideration with this design as only one tissue slice may be imaged at a time.

The current protocol describes a method by which users can maintain viability of acute hippocampal and cortical slice preparations during the collection of magnetic resonance microscopy data.

Apoyo metabólico de suprimidos, los tejidos de cerebro vivos durante la adquisición de la microscopía de resonancia magnética

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...