이 작품은 NIH 보조금 R01GM080376, R35GM118139 및 NSF 엔지니어링 메카노생물학 CMMI 센터: 15-48571에서 Y.E.G.에, 그리고 NIAID 전 박사 NRSA 펠로우십 F30AI114187에서 Rj.j..M.

참고: 모든 단계는 일반 실험실 공간에서 완료할 수 있습니다.
1. 유리 커버 슬립 청소
<ol><li>콜로이드 입자의 증발 증착을 위한 깨끗한 표면을 제공하기 위해 24 x 30mm 광학 보로실리케이트 유리 커버립(0.16-0.19 mm 두께)을 세척용 코플린 유리 스테닝 항아리의 홈 인서트 내에 배치합니다. 참고: 커버립이 똑바로 서 있고 잘 분리되어 있는지 확인하여 청소 과정에서 모든 표면이 명확하게 노출되도록 합니다.</li>
	<li>염색 항아리에 충분한 아세톤을 부어 커버를 덮고 커버를 배치하고 40 °C에서 10 분 동안 초음파 처리하십시오.</li>
	<li>아세톤을 붓고 염색 된 항아리를 증류 한 H2O로 채우고 물을 부어 커버스립을 헹구습니다. 2회 더 반복합니다.</li>
	<li>아세톤 초음파 처리(1.2 단계 및 1.3 단계)를 다시 한 번 반복합니다.</li>
	<li>40°C에서 20분 동안 커버립을 커버하고 초음파 처리하여 항아리에 충분히 200mM KOH를 붓습니다. 참고 : KOH는 유리를 약간 등점합니다.</li>
	<li>증류된 H2O 6번으로 커버립을 헹구습니다.</li>
	<li>에탄올을 추가하여 커버립을 덮고 뚜껑을 추가하고 40°C에서 10분 동안 초음파 처리합니다.</li>
	<li>증류된 H2O 3번으로 커버립을 헹구습니다.</li>
	<li>부드러운 집게를 사용하여 가장자리의 각 커버슬립을 선택하고 N2 가스로 커버립을 건조시다. 커버슬립의 가장자리만 터치합니다. 말린 청소 커버립을 각각 개별 깨끗한 페트리 접시에 놓습니다.</li>
</ol>2. 폴리스티렌 구슬의 증발 증착
<ol><li>ZMW 어레이에 대한 콜로이드 크리스탈 마스크를 생성하기 위해, 1 μm 직경의 원심분리기 50 μL, 비기능성 폴리스티렌 구슬(물 2.5% w/v)에서 15,000 x g,25°C에서 5분 동안. 참고: 구슬을 파이프팅하기 전에 구슬이 병 바닥에 정착한 경우 주식 솔루션이 잠시 소용돌이쳐야 합니다.</li>
	<li>상체를 버리고 가능한 한 적은 물을 남깁니다. 참고: 잔류물은 에탄올재서스펜션(39)의증발 특성을 변경할 수 있으므로, 모든 물을 제거하기 위해 소량의 구슬을 제거할 수 있다.</li>
	<li>1:400 TritonX-100:에탄올 용매의 50 μL에서 2.2 단계에서 구슬을 재차질한다. 파이펫을 여러 번 위아래로 사용하여 구슬을 용매와 철저히 혼합합니다. 참고: TritonX-100:에탄올 용매는 사용 후 파라핀 필름으로 밀봉하고 한 달에 한 번 신선하게 준비해야 합니다. 구슬은 마이크로 센세이퍼튜브와 같은 플라스틱 용기의 측면을 고수하는 경향이 있으므로 측면을 따라 파이펫을 사용하여 모든 구슬이 재주중단되도록 합니다.</li>
	<li>증착을 위한 습도 챔버를 설치하려면 뚜껑이 약간 남아 있는 벤치에 뚜껑이 있는 6개의 페트리 접시를 뚜껑이 있는 벤치에 놓습니다. 각 접시에서 커버슬립을 열린 영역으로 이동하여 다음 단계에서 습도가 증가할 때 커버립이 환경에 노출되도록 합니다.</li>
	<li>페트리 접시 뒤에 는 히그로미터와 작은 전기 팬을 배치합니다.</li>
	<li>실험실에서 시작 상대 습도(RH)를 기록합니다. 200mL 비커를 150-200mL의 ~75°C 물로 채우고 팬 뒤에 놓습니다.</li>
	<li>팬을 켜고 페트리 접시, 팬, 비커 및 히그로미터를 뒤집고 투명한 플라스틱 저장 용기(66cm x 46cm x 38cm)로 덮습니다.</li>
	<li>챔버의 RH가 일반적으로 5-10 분 소요 70-75 %로 상승하자. 참고: 주변 실험실 RH가 낮으면(~50% 미만)인 경우, 증착 시 습도 의 손실을 보상하기 위해 챔버가 더 높은 RH에 도달하지만 80 % 이상은 없습니다 (아래 참조).</li>
	<li>RH가 70-75%에 도달하면 RH를 기록하고 플라스틱 저장 용기를 약간 들어 올려 페트리 접시에 커버를 빠르게 배치하여 커버립의 과도하게 젖은 것을 방지합니다. 참고: 챔버의 온도는 가습의 결과로 실온, 전형적으로 25-26°C보다 약간 따뜻할 것입니다. 커버립에 습기가 보이면 유리 표면이 너무 젖습니다. 상용 장갑 상자는 프로토콜의 이 부분을 단순화할 수 있습니다.</li>
	<li>챔버의 RH가 계속 상승하여 85%로 상승하게 하십시오. 그 시점에서, 습도 챔버와 피펫 5 μL의 각 커버슬립의 중앙에 RH를 기록한다.</li>
	<li>각 증착 후 챔버와 페트리 접시를 닫아 습도의 손실을 최소화하십시오. 2분 이내에 6개의 기탁을 모두 완료하는 것을 목표로 합니다.</li>
	<li>증착 후 챔버에 RH를 기록합니다. 참고: 증착 후 RH는 증착 중에 습도가 얼마나 빨리 손실되었는지 측정하는 데 도움이 되며, 이는 주변 실험실 조건에 따라 달라집니다. 일반적인 성공적인 실행을 위해, 챔버는 증착 하기 전에 85% RH에서 시작하고 증착 후 70-75% RH에서 끝납니다.</li>
	<li>비드 방울을 5분 동안 퍼지고 건조시키십시오. 참고: 콜로이드 결정이 많은 구멍 이나 다층 영역이 있는 경우, 챔버는 각각 너무 습하거나 건조 가능성이 있었다. 페트리 접시를 닫고 기탁을 시작하는 상대 습도를 조정합니다(최적화에 대한 추가 논의를 위한 결과 섹션 참조).</li>
</ol>3. 콜로이드 크리스탈 템플릿에서 모공 크기를 줄이기위한 비드 어닐링
<ol><li>비드 간 interstices를 좁히고 interstices의 모서리를 반올림 폴리스티렌 구슬의 어닐링에 대한 균일 한 온도 표면을 제공하기 위해, 표준 세라믹 핫 플레이트 위에 평평하고 밀링 알루미늄 접시를 배치합니다.</li>
	<li>핫 플레이트의 온도를 107°C로 설정하이고,폴리스티렌(40)의유리 전이 온도. 참고: 안정적이고 정확한 온도를 얻기 위해 열전대 프로브는 알루미늄 플레이트에 2-3mm 너비와 4-5mm 깊이 구멍으로 고정되었습니다.</li>
	<li>뜨거운 알루미늄 판에 비드 템플릿이 들어 있는 커버슬립과 20s의 음막을 놓습니다(용융 시간에 대한 설명을 위한 토론 섹션 참조).</li>
	<li>가열 후 알루미늄 플레이트에서 덮개 슬립을 제거하고 신속하게 다른 실온 알루미늄 표면에 배치하여 냉각시하십시오. 참고: 커버립이 플레이트 의 가장자리에 약간 걸려 있거나 얕은 채널(첨부 된 비디오 참조)을 접시에 넣고 커버립을 쉽게 픽업하는 것이 도움이됩니다.</li>
</ol>4. 콜로이드 크리스탈 템플릿을 사용하여 알루미늄 제로 모드 도파관의 나노 제작
<ol><li>열 또는 전자 빔 증발 증착을 사용하여, 구슬 사이의 interstices에서 게시물을 생성하기 위해 콜로이드 결정 템플릿 위에 2 Å /s에 구리 의 300 nm를 예금.</li>
	<li>테이프로 표면을 부드럽게 눌러 구슬 위에 과도한 금속을 제거합니다. 테이프를 천천히 벗겨 금속을 벗깁니다. 참고: 테이프를 당긴 후에도 반사 과잉 금속의 일부 작은 패치가 남아 있을 수 있으며, 이는 종종N2 가스의 스트림에 의해 제거될 수 있다. 테이프 당김 후 반사 과잉 금속의 상당한 패치가 남아 있는 경우, 폴리스티렌 구슬을 부분적으로 용해하기 위해 2 시간 동안 톨루엔에 템플릿을 담그십시오. 커버립을 증류수로 씻고 N2로말리고 테이프 풀을 반복합니다. 비드가 테이프를 당기는 동안 기둥을 손상으로부터 보호하는 데 도움이 되기 때문에 비드를 완전히 녹여서는 안 됩니다.</li>
	<li>폴리스티렌 구슬을 녹이려면 비드 템플릿을 톨루엔에 놓고 하룻밤 동안 담가 둡니다. 주의: 톨루엔 연기는 독성이 있을 수 있습니다. 통풍이 잘 되는 후드 아래에서 톨루엔과 함께 작업하고 장갑, 안전 안경 및 실험실 코트를 포함한 개인 보호 장비를 착용하십시오. Toluene은 인화성 액체로 지정된 통풍 캐비닛에 보관해야 합니다.</li>
	<li>톨루엔 인큐베이션 후, 클로로폼으로 한 번, 에탄올로 두 번 템플릿을 헹구는 다. 섬세한 200-300 nm 높이의 금속 기둥이 노출되어 있기 때문에 핸들립은 이 시점에서 조심스럽게 커버합니다. N2로 템플릿을 건조하고 산소 플라즈마 클리너에서 잔류 폴리머 및 오염 물질을 30 분 동안 제거하십시오. 주의: 클로로폼 연기가 독성이 있을 수 있습니다. 통풍이 잘 되는 후드 아래에서 클로로폼을 착용하고 장갑, 안전 안경 및 실험실 코트를 포함한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 클로로폼은 다른 인화성 용매에서 멀리 떨어진 통풍 캐비닛에 보관해야 합니다.</li>
	<li>열 또는 전자 빔 증발 증착을 사용하여 티타늄 접착 층의 3 nm를 1 Å/s로 입금한 다음 구리 기둥 의 4 Å/s 주위와 상단에 100-150 nm의 알루미늄을 보관하십시오. 참고: 두꺼운 클래딩을 사용하여 더 깊은 가이드와 배경 형광의 감쇠를 얻을 수 있지만 다음 단계에서 게시물을 노출하고 용해한 후 수율이 감소합니다(토론 섹션 참조).</li>
	<li>금속 기둥을 용해하려면, 구리 에탄 (구연산 기반)에 커버립을 담그십시오. 재료 의 표) 2 시간 동안. 주의: 금속 에티트는 피부 화상을 일으킬 수 있습니다. 통풍이 잘 되는 후드 아래에서 에트와 함께 작업하고 보호 장비를 착용하십시오. 취급 후 손을 철저히 씻으십시오. 금속 에트트는 부식성 액체로 지정된 통풍 캐비닛에 보관해야 합니다.</li>
	<li>커버립을 증류수로 헹구고N2로말리고, 금속 클래딩 표면을 렌즈 페이퍼로 부드럽게 강화하여 클래딩으로 덮여 있는 게시물을 노출시합니다. 커버립을 구리 에트챈트에 다시 넣고 2h를 더 한 다음 증류수로 다시 헹구고 N2로건조시다. 참고: ZMW 슬라이드는 오염 물질이 없도록 커버되고 깨끗한 페트리 접시에 보관해야 합니다.</li>
</ol>5. 콜로이드 크리스탈 템플릿을 사용하여 금 제로 모드 파도파장의 나노 제작
참고: 알루미늄 ZMW를 제조하는 프로토콜을 반영하는 골드 ZMWs(보충도 1)를제조하는 방법이 이 섹션에서 제공됩니다.
<ol><li>열 또는 전자 빔 증발 증착을 사용하여 티타늄 접착 층의 3 nm를 1 Å/s로 입금한 다음 4 Å/s에서 300nm의 알루미늄을 보관하십시오.</li>
	<li>테이프로 표면을 부드럽게 눌러 구슬 위에 과도한 금속을 제거합니다. 테이프를 천천히 벗겨 금속을 벗깁니다.</li>
	<li>폴리스티렌 구슬을 녹이려면 비드 템플릿을 톨루엔에 놓고 하룻밤 동안 담가 둡니다.</li>
	<li>톨루엔 인큐베이션 후, 클로로폼으로 한 번, 에탄올로 두 번 템플릿을 헹구는 다. N2로 템플릿을 건조하고 산소 플라즈마 클리너에서 잔류 폴리머 오염 물질을 30 분 동안 제거하십시오.</li>
	<li>열 또는 전자 빔 증발 증착을 사용하여 알루미늄 기둥 의 주위에 5 Å / s 주위에 금 100-150 nm를 입금하십시오.</li>
	<li>금속 기둥을 용해하려면 알루미늄 에탕트(인산 계)에 커버립을 담그십시오. 재료 의 표) 1 시간 동안.</li>
	<li>커버립을 증류수로 헹구고N2로말리고, 금속 클래딩 표면을 렌즈 페이퍼로 부드럽게 강화하여 클래딩으로 덮여 있는 게시물을 노출시합니다. 커버립을 알루미늄 에트챈트에 1시간 동안 다시 넣고 증류수로 다시 헹구고 N2로건조시다. 참고: ZMW 슬라이드는 덮여 깨끗한 페트리 접시에 보관해야합니다.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

콜로이드 자체 조립(프로토콜 섹션 2)의 경우, 서스펜션 용매가 증발 공정을 가속화함에 따라 물 대신 에탄올을 사용하여 이전방법(48,49)과마찬가지로 1-2h가 아닌 증착 후 2-3분 안에 템플릿을 준비한다. 여기에 제시된 증발 침전 프로토콜은 또한서스펜션(49,50,51)의표면 기울기, 온도 및 공기 부피를 제어해야 하는 이전 침전 프로토콜보다 더 간단하다. 이 프로토콜에 사용되는 입자 부피 분수는 2.4%로, 이전퇴적방법(48)에사용된 0.2-0.5%보다 높으며, 이는 훨씬 더 긴 침전 시간 스케일을 위해 수량 글리세롤 혼합물에서 콜로이드를 재장중단하였다. 그러나, 기탁의 품질은 입자 부피 분획의 변화에 견고하며, 과거 연구에 따르면 2-10%49,50,51사이에서 다양할 수 있다는 것을 발견하였다. 이 프로토콜에서 성공적인 증착에서 얻은 콜로이드 결정의 입자 크기는 20-30 μm로 이전 퇴적 방법(일반적으로 수백 나노미터)의 곡물보다 큰48,49입니다. 거시적으로, 콜로이드 단층의 직경 약 2cm는 또한 이전방법(49)에의해 생성된 1cm 영역과 비교된다. 이 방법으로 생성된 콜로이드 크리스탈 템플릿의 큰 크기는 각 ZMW 슬라이드에서 3-5 개의 분리 된 유량 챔버44,각각 약 3-4mm 폭을 허용합니다. 따라서, 다중 독립적인 단일 분자 실험은 각 슬라이드에서 수행될 수 있다.
자체 조립 후 콜로이드 구슬 템플릿(프로토콜 섹션 3)을 어닐링은 간단하지만 ZMW와의 배경 형광을 충분히 줄이는 중요한 단계입니다. 보조 도 2에서 알 수 있듯이, 단층 된 템플릿에서 삼각형 단면이있는 파장에 대한 효과적인 차단 파장은 894 nm입니다. 이에 비해, 어닐템플릿으로부터 130nm 직경원형 파장에 대한 유효 차단 파장은 221nm이며, 둘 다 해석적으로(가이드18의직경의 1.7배)와 수치적으로 결정된다. 증착에 더 작은 구슬을 사용하면 템플릿 모공의 크기도 줄어들 수 있지만, 도파는 가시광선의 회절 한계 주위에 있는 200nm보다 더 가깝게 간격을 두게 됩니다. 또한, 도파는 횡단면에서 삼각형으로 유지되어 파관(보충도 2A-D)을통해 비대칭 전력 전파로 이어집니다. 어닐링 단계의 한 가지 단점은 용융 시간의 가변성이 파도어 직경의 변동을 유발할 수 있으므로 정확한 타이밍은 배치 간의 변동을 최소화하는 데 도움이 된다는 것입니다. interstices는 25 s보다 더 오래 어닐링 시간에 닫히기 시작하고, 포스트 직경은 20-25 s(보충 도 3B−D)사이에매우 많이 감소하지 않습니다. 분간 폐쇄에 대한 빠른 테스트는 어닐링 된 템플릿이 빛으로 조명되고 비스듬히 볼 때 여전히 무지개 회절 패턴을 생성하는지 여부를 확인하는 것입니다. 그렇지 않다면, 대부분의 interstices 가능성이 폐쇄. 어닐링 시간과 일반적인 모공 직경 사이의 관계는이전 38에제시되었습니다.
어닐링 단계에서 원하는 모공 크기를 달성한 후, 구리는 마스크의 그림자를 만들기 위해 템플릿에 증착(4.1 단계)된다. 금속이 템플릿에 가능한 한 수직으로 접근하면서 시야 증착 라인을 사용하는 것이 중요합니다. 따라서, 시료와 금속 원 사이의 거리를 증가시킬 뿐만 아니라 템플릿을 들고 있는 플레이트가 회전하지 않도록 보장하고, 일부 증기 증착 기계에서 자동으로 수행되는 것처럼, 폴리스티렌 기판에 금속의 측면 증착을 최소화하는 데 도움이 된다. 그러나, 일부 측면 증착은 불가피하며, 이는 중간 구멍의 크기를 감소시키고 따라서 더 많은 금속이 증착됨에 따라 포스트 단면은52를증착한다. 이로 인해 프리즘과 같은구조물(52)이아닌 피라미드 금속 기둥이 발생합니다.
구리 기둥은 프리즘 모양이 아닌 피라미드일 가능성이 있기 때문에 게시물 위에 있는 알루미늄 증착(4.5단계)은 일부 기울어지는 측면을 다루어 일부 게시물에 대한 구리 에티트의 접근성을 차단합니다. 따라서, 렌즈 종이 버핑 단계(Step 4.7 또는 5.7)는 알루미늄으로 덮여 있는 모든 구리 기둥을 기계적으로 방해하기 위해 첫 번째 에티트에 담근 후에 추가되었다. 더 높은 게시물을 만들기 위해 더 많은 구리를 증착하면 렌즈 종이 버프 동안 게시물이 기계적 중단에 더 취약해집니다. 그러나, 500nm 이상의 구리는 증착의 목적이 1 μm 구슬의 500 nm 미드라인에서 중간 구멍을 투영하기 때문에 증착되어서는 안 된다.
또 다른 잠재적인 어려움은 렌즈 용지 버핑(4.7 단계 또는 5.7 단계)에서 의도하지 않은 알루미늄 클래딩을 제거하는 것입니다. 그것은 버핑 동안 알루미늄 클래딩의 손실이 더 빈번하게 되었다는 것을 것을을 발견했습니다, 유리에 알루미늄 준수를 방해할 수 있는 증가한 폴리스티렌 잔류물로 인해 가능성이 높습니다 (프로토콜 섹션 3). 그러나 테이프 풀 후 하룻밤 톨루엔 담그(4.3 단계 또는 5.3)가 이 문제를 해결하였다. 그림 4E의AFM 이미지에서 폴리스티렌의 일부 잔류 고리는 기둥 사이에 볼 수 있지만 알루미늄 클래딩은 여전히 4.7 단계에서 여러 강화 효과를 거부했습니다. 알루미늄 클래딩의 손실이 하룻밤 톨루엔 담그 후 문제가 남아있는 경우, RCA-1 (표준 클린-1) 세척, 피라냐 세척, 또는 추가 산소 플라즈마 세척단계 4.4 또는 5.4에 추가 될 수 있습니다. 이러한 세척 단계는 또한 ZMW를 더 청소하기 위해 최종 식각 단계 (단계 4.7 또는 5.7) 및 통과 전에 추가 될 수있다.
단일 분자 FRET 실험에서 ZMWs의 성능은 EBL로 제작된 ZMWs의 성능과 유사했습니다. 이전 연구에서53Cy3 라벨 단일 분자 FRET용 용액에서 DNA 헬리케이스 로더 단백질(도 6A에서와동일한 기증자-수용자 배열), FRET 이벤트는 100 nM Cy5 배경에서 명확하게 식별가능했으며, 1M μ에서 덜 명확하고(소음에 대한 낮은 수용자 추적 신호)가 1M에서 식별가능하지 않았다. 우리는 상용 ZMWs와 이전 연구는 1 mM54로높은 배경 농도에서 단일 분자 FRET 수용 신호를보고, 우리와 다른 이전 연구보다 높은42,53 사내 제조 ZMWs와 함께 달성했다. ZMWs 중 신호 대 배경 성능에 대한 추가 논의는 Jamiolkowski 등에서 제공됩니다. ZMW표면(53)과 형광시시(53)의 비특이적 상호작용은 특히 용액에서 확산형 형광종이 큰 거대분자인 경우 더 높은 농도에 대한 접근을 제한하는 일반적인 과제이다. 번역과 같은 복잡한 생화학 시스템에 대한 ZMWs의 연구는 일반적으로 100-250 nM55,56,57,58로 자유 형광 기판농도를제한한다. ZMW의 의도된 적용에 관계없이 고농도에서 소음에 허용되는 신호를 유지하기 위해서는 다양한 시스템에 대한 통과 방법의 최적화가 필요할 것입니다.
전반적으로, 여기에 제시 된 방법은 전문 기술이나 장비가 필요하지 않으며, 한 번에 많은 템플릿을 병렬로 제작 할 수 있으며, 다른 금속에서 ZMW를 제작하도록 조정할 수 있습니다. 이 작품에서 구리와 알루미늄은 각각 알루미늄과 금으로 대체되어 금 ZMW(보충도 3)를제조하였다. 이것은 알루미늄보다는 금의 통과 방법을 사용하는 실험실에 유리합니다. 또한, 금 ZMWs는 가시 스펙트럼의 적색 영역에서 흡수되는 형광에 대한 방출을 향상시키는 것으로 나타났으며, 알루미늄 ZMWs는 녹색 영역에서 흡수되는 형광에 대한 방출을 향상시키는 것으로나타났다(59). 미래에, 이 방법으로 제작된 ZMWs로부터의 형광 신호 강도는 HF16,26,60을사용하여 ZMW 금속 클래딩 아래 유리로 에칭함으로써 향상될 수 있다. 이것은 응광형61을담금질할 수 있는 금속 벽에서 멀리 고정된 생체 분자를 가져옵니다. 더욱이, 조리개 입구 아래에 는 최대 외리 조명 강도가 있으며, 이는 이전에 단일 분자방출(26,60)을향상시키기 위해 이용되고 있다.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.
Figure 3 was updated from:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.

Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET) 또는 단일 분자 형광 상관 분광법(FCS)과 같은 단일 분자 기술은 분자 생물물리학을 위한 강력한 도구로,전사1,2,3,번역4,5,6,기타 7, 기타 7과 같은 공정에서 개별 생체 분자의 동적 움직임, 적합성 및 상호 작용의 연구를 가능하게한다. smFRET의 경우, 많은 테더드 분자가 시간이 지남에 따라 추적될 수 있기 때문에 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 검사는 일반적인 방법이며, TIR에 의해 생성된 에반센드 파는 커버슬립8에인접한 100-200 nm 영역으로 제한된다. 그러나, 이러한 포주 부피에 대한 제한에도 불구하고, 배경 형광9위의 단일 분자 신호를 검출하기 위해서는 여전히 pM 또는 nM 범위로 희석되어야 한다. 세포 효소의 Michaelis-Menten 상수는 전형적으로 mM 범위10에μM에 있기 때문에, 단일 분자 연구에서 생화확적인 반응은 일반적으로 세포에 있는 것보다 훨씬 느립니다. 예를 들어, 단백질 합성은 대장균11,12에서초당 15-20 아미노산에서 발생하며, 대부분의 대장균 리보솜은 스모트 실험에서 초당 0.1-1아미노산으로 변환된다 13. 단백질 합성에서, 정체된 리보좀에 대한 결정 구조 및 smFRET는 tRNA-mRNA 전좌 단계14,15이전에 '하이브리드'와 '고전적인' 상태 사이에서 전송 RNA(tRNAs)가 변동하는 것으로 나타났다. 그러나, 전좌 GTPase 인자, EF-G의 생리적 농도가 존재했을 때, 하이브리드와 고전 국가 사이의 상이한 형태, 중간, smFRET6에서관찰되었다. 세포에 있는 것과 유사한 비율 그리고 농도에 동적 분자 프로세스를 공부하는 것은 중요합니다, 그러나 기술적인 도전남아 있습니다.
형광 기판 농도를 증가시키는 전략은 제로 모드 파도어(ZMWs)라고 불리는 금속 계의 가시파장 조리개를 사용하여 조리개 내에서 국소화된 생체 분자를 선택적으로 자극하는 제한된 흥분 장을 생성하는 것이다(그림1). 조리개는 일반적으로 직경 100-200 nm, 깊이17에서100-150 nm입니다. 우물의 크기 및 형상과 관련된 컷오프 파장(λc≈ 유전체매체(18)로물을 가진 원형 도파관의 직경은 2.3배≈) 전파 모드가 도파관에 허용되지 않으므로, 따라서 용어 제로 모드 파도가이드. 그러나 진동하는 전자기장은 에반센드 파라고 불리는, 강도가 기하급수적으로 부패하면서도파선(18,19)으로짧은 거리를 터널링한다. TIR 에반센센트 파도와 유사하지만, ZMW 에반센센트 파도는 부패 상수를 가지며, 그 결과 도파관 내에서 10-30 nm 유효 여기 영역이 생성됩니다. 형광 으로 표지된 리간드의 미세 몰라 농도에서, 단지 하나 또는 몇몇 분자는 흥분 지역 안에 동시에 존재합니다. 흥분 부피의 이 제한 및 배경 형광의 결과적인 감소는 생물학으로 관련있는 농도에서 단 하나 분자의 형광 화상 진찰을 가능하게 합니다. 이는 단일 단백질확산(21)의FCS 측정, 저친화성 리간드단백질(22)및 단백질 단백질상호작용(23)의 단일 분자 FRET 측정, 단일 분자 회전율이벤트(24)의분광-전기화학적 측정을 포함한 많은 시스템에 적용되었다.
ZMW는 이온 빔 밀링25,26 또는 전자 빔 리소그래피(EBL)를 사용하여 금속 층을 직접 패터닝한 다음 플라즈마 에칭16,27로생산되었다. 이러한 마스크리스소그래피 방법은 일련의 파관을 생성하고 일반적으로 ZMW 기술의 광범위한 채택을 방지하여 특수 나노 제조 시설에 대한 액세스가 필요합니다. 또 다른 방법, 자외선 나노 임프린트 리소그래피 리프트 오프(28)는석영 슬라이드 금형을 사용하여 스탬프와 같은 저항 필름에 역 ZMW 템플릿을 누릅니다. 이 방법은 더 간소화되어 있지만 석영 금형을 제작하기 위해서는 EBL이 필요합니다. 이 문서에서는 EBL 또는 이온 빔 밀링을 필요로 하지 않으며 소각 마스크를 형성하기 위해 나노스피어의 밀착 포장을 기반으로 하는 간단하고 저렴한 템플릿 제작 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다.
1982년 Deckman과 Dunsmuir29,30에의해 처음 제안된 나노스피어 또는 "천연" 리소그래피는 수십 나노미터에서 수십 마이크로미터31에이르는 모노분산 콜로이드 입자의 자체 조립을 사용하여 에칭 및/또는 재료의 증착을 통한 표면 패터닝을 위한 템플릿을 만듭니다. 콜로이드 결정이라고 불리는 콜로이드 입자의 2차원(2D) 또는 3차원(3D) 확장된 주기적인 배열은 산란 및배절(32)으로부터의밝은 무지개빛 물질을 특징으로 한다. 전자 빔이나 포토리스그래피보다 덜 널리 사용되지만 이 마스킹 방법론은 간단하고 저렴한 비용으로 쉽게 축소되어 100 nm 미만의 피처 크기를 만듭니다.
콜로이드 입자의 자체 조립을 지시하는 것은 곡성 결정을 표면 패터닝을 위한 마스크로 사용하는 성공을 결정합니다. 입자의 크기와 모양이 균일한 경우, 콜로이드 입자는 엔트로피고갈기(33)에 의해 구동되는 육각형포장으로 쉽게 자체 조립될 수 있다. 낙하 코팅 후 의 수분 증발은 콜로이드 입자를 침전하는 효과적인 경로이지만, 다른 방법은 딥 코팅(34,스핀 코팅35,전기 지질 증착36)및 공기 물 인터페이스(37)에서통합을 포함한다. 아래에 제시된 프로토콜은 가장 간단한 증발 침전 방법을 기반으로 합니다. 삼각형은 희생 금속을 플레이트하는 개구부를 형성하여 구멍을 형성하는 개구부를 형성한다(그림2 및 보충 도 1). 이 단계 전에 구슬의 간략한 어닐링은 이러한 게시물의 모양과 직경을 조정합니다. 구슬이 제거되고 최종 금속 층이 게시물 주위에 증착된 다음 게시물이 제거됩니다. 콜로이드 나노 마스크에 두 개의 금속 증착 단계 후, 중간 기둥의 제거, 통과 및 테더링을위한 표면 화학 수정, ZMW 어레이는 단일 분자 이미징에 사용할 준비가되어 있습니다. 제조 후 ZMW 광학 특성의 보다 광범위한 특성화는 함께 제공되는 제38에서찾을 수 있다. 금속의 증기 증착을 위한 열 증발기 외에 특수 공구가 필요하지 않습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:667px;" width="668">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1. Glass Coverslip Cleaning</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Acetone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coplin glass staining jar</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-817</td>
			<td>Staining jar with 8 grooves and molded glass cover</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:103px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48404-467</td>
			<td>24 mm x 30 mm (No.1&#189;, Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">KOH</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R80115TS</td>
			<td>100 mm diameter, 15 mm deep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sonicator</td>
			<td style="width:103px;">Branson</td>
			<td style="width:119px;">Z245143</td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 5510</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Clear storage container</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-110-8222</td>
			<td>26 x 18 x 15 in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Desk fan</td>
			<td style="width:103px;">O2Cool</td>
			<td style="width:119px;">FD05001A</td>
			<td>Any small desk (~5 in.) fan will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glass beaker</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-555-25B</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Humidity meter</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-661-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21-402-903</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polystyrene microspheres</td>
			<td style="width:103px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">18602-15</td>
			<td>1.00 &#181;m diameter, non-functionalized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X-100 deturgent</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Aluminum plate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AA11062RY</td>
			<td>Customized in-house to 14 cm x 14 cm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Ceramic hotplate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">HP88857100</td>
			<td>13 x 8.2 x 3.8 in.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">38615K71</td>
			<td>Read temperature with thermocouple probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thermocouple probe</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">9251T93</td>
			<td>Type K, surface probe</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">Type A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAL40QXHB</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Chloroform</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">49-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMCU40QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gold pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAUXX40G</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lens paper</td>
			<td style="width:103px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:103px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:119px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:103px;">Staples</td>
			<td style="width:119px;">MMM119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Thin film deposition system</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">PVD-75</td>
			<td>Tabletop thermal evaporation system will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Titanium pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMTI45QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Toluene</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">244511</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Representative Results</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">COMSOL Multiphysics Modeling Software</td>
			<td>COMSOL, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dual View spectral splitter</td>
			<td style="width:103px;">Photometrics, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy

단일 분자 형광 효소학에서, 용액에 표지된 기판에서 배경 형광은 수시로 피코- 나노 몰라 범위에 형광포 농도를 제한하고, 많은 생리적인 리간드 농도 보다는 크기의 몇몇 순서. 알루미늄이나 금과 같은 얇은 전도 금속으로 제작된 직경 100-200 nm의 제로 모드 도파관(ZMWs)이라고 불리는 광학 나노 구조는 가시광선 내분을 제프토리터 유효 볼륨에 국한하여 형광 농도의 미세 모름 농도에서 개별 분자의 이미징을 허용합니다. 그러나, 고가의 특수 나노 제조 장비에 대한 필요성은 ZMWs의 광범위한 사용을 배제하고있다. 여기서, 콜로이드, 또는 나노권, 리소그래피는 와도파 제작을 위한 나노미터 규모의 마스크를 만드는 대안 전략으로 이용됩니다. 이 보고서는 각 단계에 대한 실질적인 고려 사항과 함께 접근 방식을 자세히 설명합니다. 이 방법을 통해 수천 개의 알루미늄 또는 골드 ZMW를 병렬로 만들 수 있으며 최종 파도어 직경과 깊이는 100-200 nm입니다. 금속 증착을 위한 일반적인 실험실 장비와 열 증발기만 필요합니다. ZMWs가 생화학 적 커뮤니티에 더 쉽게 접근 할 수 있도록함으로써,이 방법은 세포 농도 및 비율에 분자 과정의 연구를 용이하게 할 수 있습니다.

증발 침전(steps 2.1−2.13)을 통한 폴리스티렌 콜로이드 입자의 자체 조립은 용매 증발속도를 제어해야 하기 때문에 다양한 결과를 생성할 수 있다. 그러나 기탁이 빠르기 때문에(라운드당 10-15분), 절차는 다양한 주변 실험실 조건에 맞게 신속하게 최적화될 수 있습니다. 도 3A증착 및 증발 후 잘 형성된 콜로이드 템플릿을 나타낸다. 매크로, 구슬의 영역은 원형, 비드의 불투명다층 링에 의해 정의 된 테두리와. 이미지의 반투명하지만 흰색 영역은 원하는 단층 영역입니다. 도 3B는 지나치게 습한 환경에서 포장된 콜로이드 템플릿을 나타낸다(페트리 접시가 닫혔을 때 80% RH). 이러한 템플릿은 깨끗한 원형 경계를 가지고 있지 않고 바깥쪽으로 확장되는 다층 tendrils가 있는 경향이 있습니다. 증착은 허용 가능하고 후속 단계에서 사용될 수 있지만 격자의 구멍은 단일 분자 이미징을 위한 사용 가능한 ZMW 어레이 영역의 수를 감소시다. 도 3C는 지나치게 건조한 환경에서 포장된 콜로이드 템플릿(페트리 접시가 닫혔을 때 65% RH)을 나타낸다. 이러한 템플릿은 일반적으로 이상적이고 잘 분산된 템플릿에 비해 직경이 작습니다. 증착은 사용할 수 있지만, 내부로 줄무늬가 있는 다층, 흰색 영역은 이미징에 사용할 수 있는 영역을 줄입니다. 따라서, 챔버가 열리고 닫히면 공정종료를 향한 기탁이 낮은 습도에서 발생하기 때문에 한 번에 6개 이상의 기탁을 수행하는 것이 좋습니다. 도 3D는 폴리스티렌 결정으로부터 반사된 빛의 회절에 의해 생성된 무지개 패턴을 나타낸다. 이 패턴은 눈으로 크리스탈 포장의 성공과 품질을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 3E,F는 잘 포장 된 콜로이드 템플릿의 원자력 현미경 검사법 (AFM) 이미지를 보여줍니다. 곡물 사이의 결함은 증발침전물(41)에서방해로 발생하며, 뚜렷한 곡물은 10배의 목표로 볼 수 있다. 따라서, 저전력 광 현미경으로 콜로이드 기탁을 검사하는 것도 포장을 평가하는 데 사용될 수 있다.
어닐드 콜로이드 템플릿(Step 4.1)에 구리를 증착한 후, 무지개 회절 패턴은 여전히 구슬의 상부를 코팅하는 반사 금속에 의해 표시되고 강화되어야한다(도 4A,B). 템플릿은 과잉구리(도 4C)를제거하는 스카치 테이프 풀(Step 4.2) 후 반사 무지개 회절 패턴을 잃게 됩니다. 그림 4D,E는 금속 증착 후 구리 기둥의 전형적인 필드의 AFM 이미지를 보여줍니다. 도 3E의 콜로이드 결정 입자 사이의 결함은 구리 포스트 이미지에서 구리의 더 큰 영역으로 볼 수 있습니다. AFM 이미지의 분석은, 300 nm의 구리 증착 두께의 경우, 최종 구리 기둥평균 255nm(도4F)의높이와 직경 121nm(도4G)을나타낸다.
구슬이 구리 기둥 위에 있던 알루미늄 클래딩(4.5단계)의 증착, 포스트(4.6단계 및 4.7단계)의 후속 용해로 인해 도 5A−C에표시된 알루미늄 ZMW가 생성됩니다. 콜로이드 결정 입자 사이의 결함은 더 큰 개구부(도 5B)로볼 수 있습니다. 도 5C의 ZMW 센터 사이의 평균 거리는 559 nm이며, 1 μm 비드의 육각형 닫기 포장 기하학에 의해 설정된 간격과 일치합니다 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61154/61154eq1.jpg"> (20 s에 대해 안래된 폴리스티렌 템플릿을 사용하여 직경이 평균 118 nm(그림 5D,E)의직경과 충분한 직경의 파도비로 생성됩니다. 도 5D의 도파관의 높이 프로파일은 또한 ~ 120 nm 깊이임을 보여줍니다.
단일 분자 FRET는 ZMWs에서 기능성을 테스트하기 위해 수행되었다(도6A). 이미징을 위한 ZMWs의 전형적인 필드는 40 x 80 μm 시야에 > 3000 개의 도파관을 포함하는 도 6B에표시됩니다. ZMW는 이전에 설명된 프로토콜을 사용하여 먼저 통과되었다42,43. 간단히 말해서, 알루미늄 ZMWs는 알루미늄 클래딩을 코팅하기 위해 폴리(비닐포스포닉산)로 패시브되었고, 메톡시 종단형 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 비오틴 종단 PEG로 도핑되어 ZMW의 유리 바닥을 코팅하여 티올-데리브아테페(thiol-derivat) 페그를 코팅하여 페그를 코팅할 수 있다. 유동 챔버, ~20 μL 부피, 그 후 단일 분자이미징(44)을위해 시공하였다. DNA 이중제의 단일 분자 FRET 이미징은 이전에 설명된 바와 같이 수행되었다38. 간략하게, 100 pM-1 nM의 시아닌-3/cyanine-5 (Cy3/Cy5), 생체 작이 DNA 이중 (33 기본 쌍 길이) 스트렙타비딘 (5 분 배양, 0.5 mg/mL 용액)으로 기능화 된 유량 채널에서 10 분 동안 배양되었다. 표지된 거대분자의 농도는 1분자로 도파관의 20% 하중을 달성하기 위해 적정될 수 있으며, 푸아송 분산 하중(대부분 도파선, ~75%)에 기초하여 하나 이상의 분자로 로드된 <5% 도파로이끌어45. 언바운드 DNA는 핵아제 없는 이중완충제로 씻어내고 일루미네이션 버퍼(0.3% [w/v] 포도당, 300 μg/mL 포도당 산화제, 120 μg/mL 카탈라아제, 1.5m 트로락스[6-하이드록시-2,5,7,8,8,000)-ttrame-ch-trame-2-ttrame-ch-trame-2-ttrame-ch-trame-ch-9-ttrame-ch-trame-ch-trame-2-ttrame-ch-trame-chroman-chromanl-2-ttrame-chroman-chtram-chroman-chroman-2-ttrame-chroman-ch-romanill-ch-tram-chroman-chroman-1.5m... 비생체화 된 Cy5 표지 DNA 이중 (33 염기 쌍 길이)은 용액의 배경 형광으로 0, 50, 100 및 500 nM의 조명 완충제에 존재하였다. 고정된 Cy3/Cy5 이중 DNA 분자로부터의 단일 분자 FRET 추적은 에피 형광 조건에 조정된 맞춤형 TIRF 현미경으로 기록되었다. 영화는 1.48개의 숫자 조리개(NA) 100x 오일 침수 목표와 532nm 및 640 nm 발산(100ms 노출) 및 이중 보기 스펙트럼 스플리터로 기록되어 전자곱과 Cy5 방출을 전자곱 충전 결합 장치(EMCCD)에서 동시에 기록했습니다. Cy5 채널에서 단단 발포제와 단일 분자 FRET 추적은 주변 Cy5의 모든 농도에서 검출되었다(그림6C−F). 이에 비해, 단일 분자는 pM을 가진 TIRF 조명에서 낮은 nM 용액 플루오로포어농도(46)에서만검출될 수 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig1.jpg"> 그림 1: 제로 모드 도파관의 회로도. 오른쪽에 있는 단일 ZMW의 확장된 단면 다이어그램이 있는 ZMW 어레이의 다이어그램입니다. 관심 있는 단일 형광 태그 효소(형광염염을 나타내는 적색 원을 가진 갈색 리보솜) 화학적으로 고정(이 예에서 mRNA를 통해) ZMWs의 유리 바닥(전형적으로 생체화-PEG로 기능화)은 전형적인 레이저 기반 의 상피 성 현미경 설정으로 이미지될 수 있다. 532 nm 흥분광(녹색 화살표)은 조리개(100-200 nm 직경)의 작은 크기로 인해 유리 금속 경계에 반사되지만, 강도가 기하급수적으로 부패하는 비전파 에반신드센트 파는 ZMW 내에 존재한다. 이것은 10-30 nm 효과적인 조명 깊이 (조리개에서 녹색 그늘)를 초래합니다. nM에서 μM 농도에 개별 형광 리간드(녹색 원을 형광 태그로 녹색 원으로 하는 파란색 tRNA)가 추가됩니다. 조리개에 확산되고 효소와 상호 작용하는 개별 리간드는 막대한 배경 형광없이 이미지됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig2.jpg"> 그림 2: 알루미늄 ZMW 어레이를 제조하기 위해 개발된 콜로이드 측광 방법의 회로도. 직경 1μm의 폴리스티렌 구슬은 프로토콜의 섹션 2에 설명된 대로 청소유리 커버슬립에 증착되고 자체 조립됩니다. 그런 다음 구슬은 모공 크기(섹션 3)를 줄이기 위해 어닐링되고, 그 다음에는 구리 증착및 톨루엔에서 비드 해산이 뒤따릅니다. 알루미늄은 구리 기둥 의 주위를 그리고 위에 증착한 다음 선택적으로 에칭되어 나노 개퍼처 (섹션 4)의 육각형 배열을 남깁니다. 마지막 세 단계의 경우, 단면 보기는 구리 기둥과 알루미늄 ZMWs의 폭과 높이를 표시하기 위해 계획 보기의 오른쪽에 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig2large.jpg" target="_blank">제공됩니다.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg"> 그림 3: 콜로이드의 증발 증착의 대표적인 결과. (A) 최적의 콜로이드 증착의 예. (B) 조건이 이상보다 더 습한 (80 % RH)인 허용 콜로이드 증착의 예. 크리스탈 단층의 구멍이 명백합니다. (C) 조건이 최적보다 건조(65% RH)인 허용 콜로이드 증착의 예. 단층 영역은 약간 반투명하며 다층 영역은 흰색과 불투명합니다(둘레와 줄무늬 안쪽). (D) 결정에서 무지개 회절을 강조하기 위해 백색광으로 조명된 콜로이드 크리스탈. (E) 성공적인 콜로이드 증착 (스케일 바 = 10 μm)에서 육각형 포장 폴리스티렌 구슬의 단층의 AFM 이미지 (공중에 프로브 AFM을 도청). (F) 포장 된 구슬의 AFM 이미지를 확장 (스케일 바 = 2 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig4.jpg"> 그림 4: 구리 증착 후 ZMW 템플릿의 매크로 스코픽 및 현미경 이미지입니다. (A) 비드 템플릿 위에 구리의 물리적 증발 후 슬라이드 의 그림. (B) 구리 증착 후 비드 템플릿에서 무지개 회절 패턴. (C) 테이프가 당겨진 후 템플릿(오른쪽)의 그림이 과도한 구리와 테이프(왼쪽)를 제거합니다. (D) 테이프 당기고 폴리스티렌 구슬의 완전한 용해 후 구리 기둥의 AFM 이미지 (스케일 바 = 5 μm). (E) 패널 D의 배율 AFM 이미지(스케일 바 = 2 μm). (F) 구리 포스트 높이의 히스토그램(각 포스트 내최대 높이 측정으로 정의), n = 534. (G) 구리 포스트 페렛 직경의 히스토그램, n = 201. 페렛 직경은 포스트 경계에 접선되는 두 개의 평행선 사이의 최대 거리입니다(ImageJ47에서정량화). 분석을 위해 입자를 식별하기 위해 클래딩 상단과 하단 유리 표면 사이의 중간 임계값이 사용되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig5.jpg"> 그림 5: 알루미늄 ZMWs의 거시적이고 현미경 이미지입니다. (A) 구리 기둥 주변과 위에 있는 150nm의 알루미늄의 물리적 증발 증착 후 슬라이드 그림. (B) 사후 용해 후 알루미늄 ZMWs의 AFM 이미지 (스케일 바 = 5 μm). (C) 패널 B의 배율 이미지가 높다(스케일 바 = 0.2 μm). (D) 패널 C. 프로파일에서 개별 ZMW의 일반적인 깊이 프로파일은 ZMW 페렛 직경의 패널 C. (E) 히스토그램, n = 240에 그려진 녹색 선에서 가져온 프로파일. 페렛 직경은 도 4에서와같이 측정되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig6.jpg"> 그림 6: ZMWs에서 단일 분자 FRET 이미징. (A) Cy3의 단일 분자 FRET 이미징의 회로도(스케일방지), Cy5표지 DNA 이중화를 배경으로 표시된 복층. (B) 백색광 조명 아래 ZMWs의 예 필드 (스케일 바 = 10 μm). (C-F) 0(C) , 50(D), 100(E) 및 500nM(F) Cy5 표지 이중제의 존재 속에서 ZMW에 고정된 DNA 이중제의 단일 분자 FRET 레코딩. 각 농도에 대해, 상부 패널은 532nm 레이저 조명(FRET 이미징) 미만의 Cy3(녹색) 및 Cy5(빨간색) 형광 강도를 나타내며, 중간 패널은 640nm 레이저 조명(직접 수용자 흥분)하에 Cy5 형광 강도를 나타내며, 가장 낮은 패널은 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61154/61154eq2.jpg"> 원시Cy3(I) 및 Cytens에서 산출된 FRET 효율(I)을 나타낸다. 이미징 하는 동안, 여기 파장 사이 번갈아 532 그리고 640 nm 매 100 ms. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 도 1: 골드 ZMW 어레이를 제작하기 위해 개발 된 콜로이드 templating 방법의 회로도. 금 ZMW 어레이를 제조하는 프로토콜은 알루미늄 ZMW 어레이(그림 2)를 제조하는프로토콜과유사합니다. 폴리스티렌 구슬 위에 구리를 증착하는 대신 알루미늄이 증착됩니다. 톨루엔에 구슬을 녹인 후, 금은 기둥 위에 알루미늄 대신 증착됩니다. 그런 다음 알루미늄 기둥은 선택적으로 에칭되어 금 ZMW 배열을 남깁니다. 마지막 세 단계의 경우 알루미늄 게시물과 골드 ZMWs의 너비와 높이를 표시하려면 계획 보기 오른쪽에 단면 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154supfig1large.jpg" target="_blank">보기가 제공됩니다.</a>
보충 도 2: ZMWs에서 전자기장 전파의 유한 원소 모델링. (A-D) 시간 평균 Poynting 벡터(W/m2)의크기의 교차면은 단조되지 않은 템플릿(A,C)과 어닐템플릿(B,D)으로 만든 도파관을 통해 이루어진다. 그림(400nm 또는 1,000nm)에 나열된 파장에서 선형 편광 전자기 평면 파동(1W)이 하단 표면에 투사되었고, 가장 낮은 파수를 가진 가장 낮은(기본) 모드는 모델링 소프트웨어(재료 표)를 사용하여 모델링소프트웨어(재료표)를사용하여 컴퓨터되었다. 도파관의 경계는 알루미늄이나 금벽으로 잘 근사된 완벽한 전기 도체로 추정되었다. 단층 파경구 템플릿의 단면은 1 μm 직경 원의 육각형 포장에 의해 결정되었고, 생성된 삼각형 형상으로부터의 3개의 뾰족한 팁은 ~60 nm 폭으로 클리핑되어 사실적인 물리적 조리개를 모델링했다. 어닐템플릿의 단면은 직경 130nm의 원으로 근사했다. 두 파도관모두 제작 후 클래딩 깊이와 유사한 130nm 깊이를 가지고 있었다. (E,F) 400 nm와 1,000 nm의 여기 파장 이외에, 모델은 400nm에서 1,000nm 사이에 균등하게 간격을 두고 100개의 여기 파장에서 해결되었으며, 유효 모드 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61154/61154eq3.jpg"> 인덱스(k z가 와도관의 파수로 정의되어 횡단 평면의 제한으로 인해 감소되는 경우, k는 진공의 각광광파도(원형 파도)에 대해 플롯하였다. 파장의 경우, 더 높은 모드가 흥분되고 유효 모드 인덱스가 증가합니다(최대 유효 모드 지수는 1이며, 이는 전자기 평면 파가 횡구 치수로 무한한 이동하는 제한 케이스입니다). 도파관의 유효 컷오프 파장은 유효 모드 인덱스가 0으로 떨어지는 파장으로 추정되었다. 원형 가이드 λcutoff = 유한 요소 모델링 (F)에서 221 nm는 원형 파장의 컷오프 파장 (λcutoff, 분석 = 1.7d = 221 nm, d가 파도어 직경인 경우)의 이론적 예측과 일치합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154supfig2large.jpg" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 도 3: Au ZMW 제작의 대표적인 결과. (A) 금 ZMW 어레이의 매크로 그림. (B-D) 알루미늄 기둥의 AFM 이미지는 20s(C)에대해 107°C로 어닐링된 템플릿, 그리고 25s(D)에 대해 107°C로 어닐링된 템플릿이다. (E) 알루미늄 기둥의 용해 후 금 ZMWs의 AFM 이미지. (F) 패널 E.(G) 골드 ZMW의 전형적인 깊이 프로파일의 높은 배율 AFM 이미지. 패널 F에 그려진 녹색 선에서 가져온 프로파일(B, C, D및 F의1 μm = E의5 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154supfig3large.jpg" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

여기에 설명된 나노피어 리소그래피 방법은 형광구의 나노-마이크로몰라 농도에서 단일 분자 이미징을 위한 금속 입은 유리 현미경 커버슬립에서 나노 개구체의 배열인 제로 모드 파휘도의 병렬 제작을 위한 나노스피어 리소그래피 방법입니다. 이 방법은 콜로이드 크리스탈 자체 어셈블리를 활용하여 도파관 템플릿을 만듭니다.

고농도 단일 분자 현미경 검사용 제로 모드 파도가이드 제조

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

fabrication-zero-mode-waveguides-for-high-concentration-single

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.9K 조회수.  University of Pennsylvania. 여기에 설명된 나노피어 리소그래피 방법은 형광구의 나노-마이크로몰라 농도에서 단일 분자 이미징을 위한 금속 입은 유리 현미경 커버슬립에서 나노 개구체의 배열인 제로 모드 파휘도의 병렬 제작을 위한 나노스피어 리소그래피 방법입니다. 이 방법은 콜로이드 크리스탈 자체 어셈블리를 활용하여 도파관 템플릿을 만듭니다.

비디오: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

상관 라이트 / 전자 현미경을위한 저가의 Cryo - 라이트 현미경 스테이지 제작

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

연구

생체공학

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Fabrication of Carbon Nanotube High-Frequency Nanoelectronic Biosensor for Sensing in High Ionic Strength Solutions

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them good candidates for high sensitivity biosensors. When a charged molecule binds to such a sensor surface, it alters the carrier density5 in the sensor, resulting in changes in its DC conductance. However, in an ionic solution a charged surface also attracts counter-ions from the solution, forming an electrical double layer (EDL). This EDL effectively screens off the charge, and in physiologically relevant conditions ~100 millimolar (mM), the characteristic charge screening length (Debye length) is less than a nanometer (nm). Thus, in high ionic strength solutions, charge based (DC) detection is fundamentally impeded6-8.
We overcome charge screening effects by detecting molecular dipoles rather than charges at high frequency, by operating carbon nanotube field effect transistors as high frequency mixers9-11. At high frequencies, the AC drive force can no longer overcome the solution drag and the ions in solution do not have sufficient time to form the EDL. Further, frequency mixing technique allows us to operate at frequencies high enough to overcome ionic screening, and yet detect the sensing signals at lower frequencies11-12. Also, the high transconductance of SWNT transistors provides an internal gain for the sensing signal, which obviates the need for external signal amplifier.
Here, we describe the protocol to (a) fabricate SWNT transistors, (b) functionalize biomolecules to the nanotube13, (c) design and stamp a poly-dimethylsiloxane (PDMS) micro-fluidic chamber14 onto the device, and (d) carry out high frequency sensing in different ionic strength solutions11.

We describe the device fabrication and measurement protocol for carbon nanotube based high frequency biosensors. The high frequency sensing technique mitigates the fundamental ionic (Debye) screening effect and allows nanotube biosensor to be operated in high ionic strength solutions where conventional electronic biosensors fail. Our technology provides a unique platform for point-of-care (POC) electronic biosensors operating in physiologically relevant conditions.

높은 이온 강도 솔루션에 감지하기위한 탄소 나노 튜브 고주파 나노 바이오 센서의 제작

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

단일 세포 및 3D 감금 단일 배아 주문 : 하이 콘텐츠 스크리닝을위한 새로운 장치

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

운모의 준비 고해상도 광학 현미경 이미징 지질 이중층 지원

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Microtoroid 광 공진기를 사용하여 라벨이없는 단일 분자 검출

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...