이 작품은 NIH 보조금 R01GM080376, R35GM118139 및 NSF 엔지니어링 메카노생물학 CMMI 센터: 15-48571에서 Y.E.G.에, 그리고 NIAID 전 박사 NRSA 펠로우십 F30AI114187에서 Rj.j..M.

참고: 모든 단계는 일반 실험실 공간에서 완료할 수 있습니다.
1. 유리 커버 슬립 청소
<ol><li>콜로이드 입자의 증발 증착을 위한 깨끗한 표면을 제공하기 위해 24 x 30mm 광학 보로실리케이트 유리 커버립(0.16-0.19 mm 두께)을 세척용 코플린 유리 스테닝 항아리의 홈 인서트 내에 배치합니다. 참고: 커버립이 똑바로 서 있고 잘 분리되어 있는지 확인하여 청소 과정에서 모든 표면이 명확하게 노출되도록 합니다.</li>
	<li>염색 항아리에 충분한 아세톤을 부어 커버를 덮고 커버를 배치하고 40 °C에서 10 분 동안 초음파 처리하십시오.</li>
	<li>아세톤을 붓고 염색 된 항아리를 증류 한 H2O로 채우고 물을 부어 커버스립을 헹구습니다. 2회 더 반복합니다.</li>
	<li>아세톤 초음파 처리(1.2 단계 및 1.3 단계)를 다시 한 번 반복합니다.</li>
	<li>40°C에서 20분 동안 커버립을 커버하고 초음파 처리하여 항아리에 충분히 200mM KOH를 붓습니다. 참고 : KOH는 유리를 약간 등점합니다.</li>
	<li>증류된 H2O 6번으로 커버립을 헹구습니다.</li>
	<li>에탄올을 추가하여 커버립을 덮고 뚜껑을 추가하고 40°C에서 10분 동안 초음파 처리합니다.</li>
	<li>증류된 H2O 3번으로 커버립을 헹구습니다.</li>
	<li>부드러운 집게를 사용하여 가장자리의 각 커버슬립을 선택하고 N2 가스로 커버립을 건조시다. 커버슬립의 가장자리만 터치합니다. 말린 청소 커버립을 각각 개별 깨끗한 페트리 접시에 놓습니다.</li>
</ol>2. 폴리스티렌 구슬의 증발 증착
<ol><li>ZMW 어레이에 대한 콜로이드 크리스탈 마스크를 생성하기 위해, 1 μm 직경의 원심분리기 50 μL, 비기능성 폴리스티렌 구슬(물 2.5% w/v)에서 15,000 x g,25°C에서 5분 동안. 참고: 구슬을 파이프팅하기 전에 구슬이 병 바닥에 정착한 경우 주식 솔루션이 잠시 소용돌이쳐야 합니다.</li>
	<li>상체를 버리고 가능한 한 적은 물을 남깁니다. 참고: 잔류물은 에탄올재서스펜션(39)의증발 특성을 변경할 수 있으므로, 모든 물을 제거하기 위해 소량의 구슬을 제거할 수 있다.</li>
	<li>1:400 TritonX-100:에탄올 용매의 50 μL에서 2.2 단계에서 구슬을 재차질한다. 파이펫을 여러 번 위아래로 사용하여 구슬을 용매와 철저히 혼합합니다. 참고: TritonX-100:에탄올 용매는 사용 후 파라핀 필름으로 밀봉하고 한 달에 한 번 신선하게 준비해야 합니다. 구슬은 마이크로 센세이퍼튜브와 같은 플라스틱 용기의 측면을 고수하는 경향이 있으므로 측면을 따라 파이펫을 사용하여 모든 구슬이 재주중단되도록 합니다.</li>
	<li>증착을 위한 습도 챔버를 설치하려면 뚜껑이 약간 남아 있는 벤치에 뚜껑이 있는 6개의 페트리 접시를 뚜껑이 있는 벤치에 놓습니다. 각 접시에서 커버슬립을 열린 영역으로 이동하여 다음 단계에서 습도가 증가할 때 커버립이 환경에 노출되도록 합니다.</li>
	<li>페트리 접시 뒤에 는 히그로미터와 작은 전기 팬을 배치합니다.</li>
	<li>실험실에서 시작 상대 습도(RH)를 기록합니다. 200mL 비커를 150-200mL의 ~75°C 물로 채우고 팬 뒤에 놓습니다.</li>
	<li>팬을 켜고 페트리 접시, 팬, 비커 및 히그로미터를 뒤집고 투명한 플라스틱 저장 용기(66cm x 46cm x 38cm)로 덮습니다.</li>
	<li>챔버의 RH가 일반적으로 5-10 분 소요 70-75 %로 상승하자. 참고: 주변 실험실 RH가 낮으면(~50% 미만)인 경우, 증착 시 습도 의 손실을 보상하기 위해 챔버가 더 높은 RH에 도달하지만 80 % 이상은 없습니다 (아래 참조).</li>
	<li>RH가 70-75%에 도달하면 RH를 기록하고 플라스틱 저장 용기를 약간 들어 올려 페트리 접시에 커버를 빠르게 배치하여 커버립의 과도하게 젖은 것을 방지합니다. 참고: 챔버의 온도는 가습의 결과로 실온, 전형적으로 25-26°C보다 약간 따뜻할 것입니다. 커버립에 습기가 보이면 유리 표면이 너무 젖습니다. 상용 장갑 상자는 프로토콜의 이 부분을 단순화할 수 있습니다.</li>
	<li>챔버의 RH가 계속 상승하여 85%로 상승하게 하십시오. 그 시점에서, 습도 챔버와 피펫 5 μL의 각 커버슬립의 중앙에 RH를 기록한다.</li>
	<li>각 증착 후 챔버와 페트리 접시를 닫아 습도의 손실을 최소화하십시오. 2분 이내에 6개의 기탁을 모두 완료하는 것을 목표로 합니다.</li>
	<li>증착 후 챔버에 RH를 기록합니다. 참고: 증착 후 RH는 증착 중에 습도가 얼마나 빨리 손실되었는지 측정하는 데 도움이 되며, 이는 주변 실험실 조건에 따라 달라집니다. 일반적인 성공적인 실행을 위해, 챔버는 증착 하기 전에 85% RH에서 시작하고 증착 후 70-75% RH에서 끝납니다.</li>
	<li>비드 방울을 5분 동안 퍼지고 건조시키십시오. 참고: 콜로이드 결정이 많은 구멍 이나 다층 영역이 있는 경우, 챔버는 각각 너무 습하거나 건조 가능성이 있었다. 페트리 접시를 닫고 기탁을 시작하는 상대 습도를 조정합니다(최적화에 대한 추가 논의를 위한 결과 섹션 참조).</li>
</ol>3. 콜로이드 크리스탈 템플릿에서 모공 크기를 줄이기위한 비드 어닐링
<ol><li>비드 간 interstices를 좁히고 interstices의 모서리를 반올림 폴리스티렌 구슬의 어닐링에 대한 균일 한 온도 표면을 제공하기 위해, 표준 세라믹 핫 플레이트 위에 평평하고 밀링 알루미늄 접시를 배치합니다.</li>
	<li>핫 플레이트의 온도를 107°C로 설정하이고,폴리스티렌(40)의유리 전이 온도. 참고: 안정적이고 정확한 온도를 얻기 위해 열전대 프로브는 알루미늄 플레이트에 2-3mm 너비와 4-5mm 깊이 구멍으로 고정되었습니다.</li>
	<li>뜨거운 알루미늄 판에 비드 템플릿이 들어 있는 커버슬립과 20s의 음막을 놓습니다(용융 시간에 대한 설명을 위한 토론 섹션 참조).</li>
	<li>가열 후 알루미늄 플레이트에서 덮개 슬립을 제거하고 신속하게 다른 실온 알루미늄 표면에 배치하여 냉각시하십시오. 참고: 커버립이 플레이트 의 가장자리에 약간 걸려 있거나 얕은 채널(첨부 된 비디오 참조)을 접시에 넣고 커버립을 쉽게 픽업하는 것이 도움이됩니다.</li>
</ol>4. 콜로이드 크리스탈 템플릿을 사용하여 알루미늄 제로 모드 도파관의 나노 제작
<ol><li>열 또는 전자 빔 증발 증착을 사용하여, 구슬 사이의 interstices에서 게시물을 생성하기 위해 콜로이드 결정 템플릿 위에 2 Å /s에 구리 의 300 nm를 예금.</li>
	<li>테이프로 표면을 부드럽게 눌러 구슬 위에 과도한 금속을 제거합니다. 테이프를 천천히 벗겨 금속을 벗깁니다. 참고: 테이프를 당긴 후에도 반사 과잉 금속의 일부 작은 패치가 남아 있을 수 있으며, 이는 종종N2 가스의 스트림에 의해 제거될 수 있다. 테이프 당김 후 반사 과잉 금속의 상당한 패치가 남아 있는 경우, 폴리스티렌 구슬을 부분적으로 용해하기 위해 2 시간 동안 톨루엔에 템플릿을 담그십시오. 커버립을 증류수로 씻고 N2로말리고 테이프 풀을 반복합니다. 비드가 테이프를 당기는 동안 기둥을 손상으로부터 보호하는 데 도움이 되기 때문에 비드를 완전히 녹여서는 안 됩니다.</li>
	<li>폴리스티렌 구슬을 녹이려면 비드 템플릿을 톨루엔에 놓고 하룻밤 동안 담가 둡니다. 주의: 톨루엔 연기는 독성이 있을 수 있습니다. 통풍이 잘 되는 후드 아래에서 톨루엔과 함께 작업하고 장갑, 안전 안경 및 실험실 코트를 포함한 개인 보호 장비를 착용하십시오. Toluene은 인화성 액체로 지정된 통풍 캐비닛에 보관해야 합니다.</li>
	<li>톨루엔 인큐베이션 후, 클로로폼으로 한 번, 에탄올로 두 번 템플릿을 헹구는 다. 섬세한 200-300 nm 높이의 금속 기둥이 노출되어 있기 때문에 핸들립은 이 시점에서 조심스럽게 커버합니다. N2로 템플릿을 건조하고 산소 플라즈마 클리너에서 잔류 폴리머 및 오염 물질을 30 분 동안 제거하십시오. 주의: 클로로폼 연기가 독성이 있을 수 있습니다. 통풍이 잘 되는 후드 아래에서 클로로폼을 착용하고 장갑, 안전 안경 및 실험실 코트를 포함한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 클로로폼은 다른 인화성 용매에서 멀리 떨어진 통풍 캐비닛에 보관해야 합니다.</li>
	<li>열 또는 전자 빔 증발 증착을 사용하여 티타늄 접착 층의 3 nm를 1 Å/s로 입금한 다음 구리 기둥 의 4 Å/s 주위와 상단에 100-150 nm의 알루미늄을 보관하십시오. 참고: 두꺼운 클래딩을 사용하여 더 깊은 가이드와 배경 형광의 감쇠를 얻을 수 있지만 다음 단계에서 게시물을 노출하고 용해한 후 수율이 감소합니다(토론 섹션 참조).</li>
	<li>금속 기둥을 용해하려면, 구리 에탄 (구연산 기반)에 커버립을 담그십시오. 재료 의 표) 2 시간 동안. 주의: 금속 에티트는 피부 화상을 일으킬 수 있습니다. 통풍이 잘 되는 후드 아래에서 에트와 함께 작업하고 보호 장비를 착용하십시오. 취급 후 손을 철저히 씻으십시오. 금속 에트트는 부식성 액체로 지정된 통풍 캐비닛에 보관해야 합니다.</li>
	<li>커버립을 증류수로 헹구고N2로말리고, 금속 클래딩 표면을 렌즈 페이퍼로 부드럽게 강화하여 클래딩으로 덮여 있는 게시물을 노출시합니다. 커버립을 구리 에트챈트에 다시 넣고 2h를 더 한 다음 증류수로 다시 헹구고 N2로건조시다. 참고: ZMW 슬라이드는 오염 물질이 없도록 커버되고 깨끗한 페트리 접시에 보관해야 합니다.</li>
</ol>5. 콜로이드 크리스탈 템플릿을 사용하여 금 제로 모드 파도파장의 나노 제작
참고: 알루미늄 ZMW를 제조하는 프로토콜을 반영하는 골드 ZMWs(보충도 1)를제조하는 방법이 이 섹션에서 제공됩니다.
<ol><li>열 또는 전자 빔 증발 증착을 사용하여 티타늄 접착 층의 3 nm를 1 Å/s로 입금한 다음 4 Å/s에서 300nm의 알루미늄을 보관하십시오.</li>
	<li>테이프로 표면을 부드럽게 눌러 구슬 위에 과도한 금속을 제거합니다. 테이프를 천천히 벗겨 금속을 벗깁니다.</li>
	<li>폴리스티렌 구슬을 녹이려면 비드 템플릿을 톨루엔에 놓고 하룻밤 동안 담가 둡니다.</li>
	<li>톨루엔 인큐베이션 후, 클로로폼으로 한 번, 에탄올로 두 번 템플릿을 헹구는 다. N2로 템플릿을 건조하고 산소 플라즈마 클리너에서 잔류 폴리머 오염 물질을 30 분 동안 제거하십시오.</li>
	<li>열 또는 전자 빔 증발 증착을 사용하여 알루미늄 기둥 의 주위에 5 Å / s 주위에 금 100-150 nm를 입금하십시오.</li>
	<li>금속 기둥을 용해하려면 알루미늄 에탕트(인산 계)에 커버립을 담그십시오. 재료 의 표) 1 시간 동안.</li>
	<li>커버립을 증류수로 헹구고N2로말리고, 금속 클래딩 표면을 렌즈 페이퍼로 부드럽게 강화하여 클래딩으로 덮여 있는 게시물을 노출시합니다. 커버립을 알루미늄 에트챈트에 1시간 동안 다시 넣고 증류수로 다시 헹구고 N2로건조시다. 참고: ZMW 슬라이드는 덮여 깨끗한 페트리 접시에 보관해야합니다.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

콜로이드 자체 조립(프로토콜 섹션 2)의 경우, 서스펜션 용매가 증발 공정을 가속화함에 따라 물 대신 에탄올을 사용하여 이전방법(48,49)과마찬가지로 1-2h가 아닌 증착 후 2-3분 안에 템플릿을 준비한다. 여기에 제시된 증발 침전 프로토콜은 또한서스펜션(49,50,51)의표면 기울기, 온도 및 공기 ?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.
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<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

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Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET) 또는 단일 분자 형광 상관 분광법(FCS)과 같은 단일 분자 기술은 분자 생물물리학을 위한 강력한 도구로,전사1,2,3,번역4,5,6,기타 7, 기타 7과 같은 공정에서 개별 생체 분자의 동적 움직임, 적합성 및 상호 작용의 연구를 가능하게한다. smFRET의 경우, 많은 테더드 분자가 시간이 지남에 따라 추적될 수 있기 때문에 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 검사는 일반적인 방법이며, TIR에 의해 생성된 에반센드 파는 커버슬립8에인접한 100-200 nm 영역으로 제한된다. 그러나, 이러한 포주 부피에 대한 제한에도 불구하고, 배경 형광9위의 단일 분자 신호를 검출하기 위해서는 여전히 pM 또는 nM 범위로 희석되어야 한다. 세포 효소의 Michaelis-Menten 상수는 전형적으로 mM 범위10에μM에 있기 때문에, 단일 분자 연구에서 생화확적인 반응은 일반적으로 세포에 있는 것보다 훨씬 느립니다. 예를 들어, 단백질 합성은 대장균11,12에서초당 15-20 아미노산에서 발생하며, 대부분의 대장균 리보솜은 스모트 실험에서 초당 0.1-1아미노산으로 변환된다 13. 단백질 합성에서, 정체된 리보좀에 대한 결정 구조 및 smFRET는 tRNA-mRNA 전좌 단계14,15이전에 '하이브리드'와 '고전적인' 상태 사이에서 전송 RNA(tRNAs)가 변동하는 것으로 나타났다. 그러나, 전좌 GTPase 인자, EF-G의 생리적 농도가 존재했을 때, 하이브리드와 고전 국가 사이의 상이한 형태, 중간, smFRET6에서관찰되었다. 세포에 있는 것과 유사한 비율 그리고 농도에 동적 분자 프로세스를 공부하는 것은 중요합니다, 그러나 기술적인 도전남아 있습니다.
형광 기판 농도를 증가시키는 전략은 제로 모드 파도어(ZMWs)라고 불리는 금속 계의 가시파장 조리개를 사용하여 조리개 내에서 국소화된 생체 분자를 선택적으로 자극하는 제한된 흥분 장을 생성하는 것이다(그림1). 조리개는 일반적으로 직경 100-200 nm, 깊이17에서100-150 nm입니다. 우물의 크기 및 형상과 관련된 컷오프 파장(λc≈ 유전체매체(18)로물을 가진 원형 도파관의 직경은 2.3배≈) 전파 모드가 도파관에 허용되지 않으므로, 따라서 용어 제로 모드 파도가이드. 그러나 진동하는 전자기장은 에반센드 파라고 불리는, 강도가 기하급수적으로 부패하면서도파선(18,19)으로짧은 거리를 터널링한다. TIR 에반센센트 파도와 유사하지만, ZMW 에반센센트 파도는 부패 상수를 가지며, 그 결과 도파관 내에서 10-30 nm 유효 여기 영역이 생성됩니다. 형광 으로 표지된 리간드의 미세 몰라 농도에서, 단지 하나 또는 몇몇 분자는 흥분 지역 안에 동시에 존재합니다. 흥분 부피의 이 제한 및 배경 형광의 결과적인 감소는 생물학으로 관련있는 농도에서 단 하나 분자의 형광 화상 진찰을 가능하게 합니다. 이는 단일 단백질확산(21)의FCS 측정, 저친화성 리간드단백질(22)및 단백질 단백질상호작용(23)의 단일 분자 FRET 측정, 단일 분자 회전율이벤트(24)의분광-전기화학적 측정을 포함한 많은 시스템에 적용되었다.
ZMW는 이온 빔 밀링25,26 또는 전자 빔 리소그래피(EBL)를 사용하여 금속 층을 직접 패터닝한 다음 플라즈마 에칭16,27로생산되었다. 이러한 마스크리스소그래피 방법은 일련의 파관을 생성하고 일반적으로 ZMW 기술의 광범위한 채택을 방지하여 특수 나노 제조 시설에 대한 액세스가 필요합니다. 또 다른 방법, 자외선 나노 임프린트 리소그래피 리프트 오프(28)는석영 슬라이드 금형을 사용하여 스탬프와 같은 저항 필름에 역 ZMW 템플릿을 누릅니다. 이 방법은 더 간소화되어 있지만 석영 금형을 제작하기 위해서는 EBL이 필요합니다. 이 문서에서는 EBL 또는 이온 빔 밀링을 필요로 하지 않으며 소각 마스크를 형성하기 위해 나노스피어의 밀착 포장을 기반으로 하는 간단하고 저렴한 템플릿 제작 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다.
1982년 Deckman과 Dunsmuir29,30에의해 처음 제안된 나노스피어 또는 "천연" 리소그래피는 수십 나노미터에서 수십 마이크로미터31에이르는 모노분산 콜로이드 입자의 자체 조립을 사용하여 에칭 및/또는 재료의 증착을 통한 표면 패터닝을 위한 템플릿을 만듭니다. 콜로이드 결정이라고 불리는 콜로이드 입자의 2차원(2D) 또는 3차원(3D) 확장된 주기적인 배열은 산란 및배절(32)으로부터의밝은 무지개빛 물질을 특징으로 한다. 전자 빔이나 포토리스그래피보다 덜 널리 사용되지만 이 마스킹 방법론은 간단하고 저렴한 비용으로 쉽게 축소되어 100 nm 미만의 피처 크기를 만듭니다.
콜로이드 입자의 자체 조립을 지시하는 것은 곡성 결정을 표면 패터닝을 위한 마스크로 사용하는 성공을 결정합니다. 입자의 크기와 모양이 균일한 경우, 콜로이드 입자는 엔트로피고갈기(33)에 의해 구동되는 육각형포장으로 쉽게 자체 조립될 수 있다. 낙하 코팅 후 의 수분 증발은 콜로이드 입자를 침전하는 효과적인 경로이지만, 다른 방법은 딥 코팅(34,스핀 코팅35,전기 지질 증착36)및 공기 물 인터페이스(37)에서통합을 포함한다. 아래에 제시된 프로토콜은 가장 간단한 증발 침전 방법을 기반으로 합니다. 삼각형은 희생 금속을 플레이트하는 개구부를 형성하여 구멍을 형성하는 개구부를 형성한다(그림2 및 보충 도 1). 이 단계 전에 구슬의 간략한 어닐링은 이러한 게시물의 모양과 직경을 조정합니다. 구슬이 제거되고 최종 금속 층이 게시물 주위에 증착된 다음 게시물이 제거됩니다. 콜로이드 나노 마스크에 두 개의 금속 증착 단계 후, 중간 기둥의 제거, 통과 및 테더링을위한 표면 화학 수정, ZMW 어레이는 단일 분자 이미징에 사용할 준비가되어 있습니다. 제조 후 ZMW 광학 특성의 보다 광범위한 특성화는 함께 제공되는 제38에서찾을 수 있다. 금속의 증기 증착을 위한 열 증발기 외에 특수 공구가 필요하지 않습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:667px;" width="668">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1. Glass Coverslip Cleaning</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Acetone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coplin glass staining jar</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-817</td>
			<td>Staining jar with 8 grooves and molded glass cover</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:103px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48404-467</td>
			<td>24 mm x 30 mm (No.1&#189;, Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">KOH</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R80115TS</td>
			<td>100 mm diameter, 15 mm deep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sonicator</td>
			<td style="width:103px;">Branson</td>
			<td style="width:119px;">Z245143</td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 5510</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Clear storage container</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-110-8222</td>
			<td>26 x 18 x 15 in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Desk fan</td>
			<td style="width:103px;">O2Cool</td>
			<td style="width:119px;">FD05001A</td>
			<td>Any small desk (~5 in.) fan will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glass beaker</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-555-25B</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Humidity meter</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-661-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21-402-903</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polystyrene microspheres</td>
			<td style="width:103px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">18602-15</td>
			<td>1.00 &#181;m diameter, non-functionalized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X-100 deturgent</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Aluminum plate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AA11062RY</td>
			<td>Customized in-house to 14 cm x 14 cm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Ceramic hotplate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">HP88857100</td>
			<td>13 x 8.2 x 3.8 in.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">38615K71</td>
			<td>Read temperature with thermocouple probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thermocouple probe</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">9251T93</td>
			<td>Type K, surface probe</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">Type A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAL40QXHB</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Chloroform</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">49-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMCU40QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gold pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAUXX40G</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lens paper</td>
			<td style="width:103px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:103px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:119px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:103px;">Staples</td>
			<td style="width:119px;">MMM119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Thin film deposition system</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">PVD-75</td>
			<td>Tabletop thermal evaporation system will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Titanium pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMTI45QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Toluene</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">244511</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Representative Results</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">COMSOL Multiphysics Modeling Software</td>
			<td>COMSOL, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dual View spectral splitter</td>
			<td style="width:103px;">Photometrics, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy

단일 분자 형광 효소학에서, 용액에 표지된 기판에서 배경 형광은 수시로 피코- 나노 몰라 범위에 형광포 농도를 제한하고, 많은 생리적인 리간드 농도 보다는 크기의 몇몇 순서. 알루미늄이나 금과 같은 얇은 전도 금속으로 제작된 직경 100-200 nm의 제로 모드 도파관(ZMWs)이라고 불리는 광학 나노 구조는 가시광선 내분을 제프토리터 유효 볼륨에 국한하여 형광 농도의 미세 모름 농도에서 개별 분자의 이미징을 허용합니다. 그러나, 고가의 특수 나노 제조 장비에 대한 필요성은 ZMWs의 광범위한 사용을 배제하고있다. 여기서, 콜로이드, 또는 나노권, 리소그래피는 와도파 제작을 위한 나노미터 규모의 마스크를 만드는 대안 전략으로 이용됩니다. 이 보고서는 각 단계에 대한 실질적인 고려 사항과 함께 접근 방식을 자세히 설명합니다. 이 방법을 통해 수천 개의 알루미늄 또는 골드 ZMW를 병렬로 만들 수 있으며 최종 파도어 직경과 깊이는 100-200 nm입니다. 금속 증착을 위한 일반적인 실험실 장비와 열 증발기만 필요합니다. ZMWs가 생화학 적 커뮤니티에 더 쉽게 접근 할 수 있도록함으로써,이 방법은 세포 농도 및 비율에 분자 과정의 연구를 용이하게 할 수 있습니다.

증발 침전(steps 2.1−2.13)을 통한 폴리스티렌 콜로이드 입자의 자체 조립은 용매 증발속도를 제어해야 하기 때문에 다양한 결과를 생성할 수 있다. 그러나 기탁이 빠르기 때문에(라운드당 10-15분), 절차는 다양한 주변 실험실 조건에 맞게 신속하게 최적화될 수 있습니다. 도 3A증착 및 증발 후 잘 형성된 콜로이드 템플릿을 나타낸다. 매크로, 구슬의 영역은 원형, 비드의 불투명?...

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Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

여기에 설명된 나노피어 리소그래피 방법은 형광구의 나노-마이크로몰라 농도에서 단일 분자 이미징을 위한 금속 입은 유리 현미경 커버슬립에서 나노 개구체의 배열인 제로 모드 파휘도의 병렬 제작을 위한 나노스피어 리소그래피 방법입니다. 이 방법은 콜로이드 크리스탈 자체 어셈블리를 활용하여 도파관 템플릿을 만듭니다.

고농도 단일 분자 현미경 검사용 제로 모드 파도가이드 제조

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

fabrication-zero-mode-waveguides-for-high-concentration-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.8K 조회수.  University of Pennsylvania. 여기에 설명된 나노피어 리소그래피 방법은 형광구의 나노-마이크로몰라 농도에서 단일 분자 이미징을 위한 금속 입은 유리 현미경 커버슬립에서 나노 개구체의 배열인 제로 모드 파휘도의 병렬 제작을 위한 나노스피어 리소그래피 방법입니다. 이 방법은 콜로이드 크리스탈 자체 어셈블리를 활용하여 도파관 템플릿을 만듭니다.

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Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

상관 라이트 / 전자 현미경을위한 저가의 Cryo - 라이트 현미경 스테이지 제작

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

연구

생체공학

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Fabrication of Carbon Nanotube High-Frequency Nanoelectronic Biosensor for Sensing in High Ionic Strength Solutions

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them good candidates for high sensitivity biosensors. When a charged molecule binds to such a sensor surface, it alters the carrier density5 in the sensor, resulting in changes in its DC conductance. However, in an ionic solution a charged surface also attracts counter-ions from the solution, forming an electrical double layer (EDL). This EDL effectively screens off the charge, and in physiologically relevant conditions ~100 millimolar (mM), the characteristic charge screening length (Debye length) is less than a nanometer (nm). Thus, in high ionic strength solutions, charge based (DC) detection is fundamentally impeded6-8.
We overcome charge screening effects by detecting molecular dipoles rather than charges at high frequency, by operating carbon nanotube field effect transistors as high frequency mixers9-11. At high frequencies, the AC drive force can no longer overcome the solution drag and the ions in solution do not have sufficient time to form the EDL. Further, frequency mixing technique allows us to operate at frequencies high enough to overcome ionic screening, and yet detect the sensing signals at lower frequencies11-12. Also, the high transconductance of SWNT transistors provides an internal gain for the sensing signal, which obviates the need for external signal amplifier.
Here, we describe the protocol to (a) fabricate SWNT transistors, (b) functionalize biomolecules to the nanotube13, (c) design and stamp a poly-dimethylsiloxane (PDMS) micro-fluidic chamber14 onto the device, and (d) carry out high frequency sensing in different ionic strength solutions11.

We describe the device fabrication and measurement protocol for carbon nanotube based high frequency biosensors. The high frequency sensing technique mitigates the fundamental ionic (Debye) screening effect and allows nanotube biosensor to be operated in high ionic strength solutions where conventional electronic biosensors fail. Our technology provides a unique platform for point-of-care (POC) electronic biosensors operating in physiologically relevant conditions.

높은 이온 강도 솔루션에 감지하기위한 탄소 나노 튜브 고주파 나노 바이오 센서의 제작

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using sonication, mechanical agitation, microfluidic devices, or homogenization. Recently, lipid-based oxygen microbubbles (LOMs) have been designed to deliver oxygen intravenously during medical emergencies, reversing life-threatening hypoxemia, and preventing subsequent organ injury, cardiac arrest, and death. We present methods for scaled-up production of highly oxygenated microbubbles using a closed-loop high-shear homogenizer. The process can produce 2 L of concentrated LOMs (90% by volume) in 90 min. Resulting bubbles have a mean diameter of ~2 &#956;m, and a rheologic profile consistent with that of blood when diluted to 60 volume %. This technique produces LOMs in high capacity and with high oxygen purity, suggesting that this technique may be useful for translational research labs.

We describe methods for the manufacture of large volumes of lipid-based oxygen microbubbles (LOMs) designed for intravenous oxygen delivery using high-shear homogenization and serial concentration.

높은 가위 균질화 및 시리얼 농도로 농축, 지질 기반 산소 마이크로 버블 에멀젼의 제조

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Microtoroid 광 공진기를 사용하여 라벨이없는 단일 분자 검출

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic resonance (MR) microscopy data. While it is possible to perform MR collections on living, excised mammalian tissue, such experiments have traditionally been constrained by resolution limits and are thus incapable of visualizing tissue microstructure. Conversely, MR protocols that did achieve microscopic image resolution required the use of fixed samples to accommodate the need for static, unchanging conditions over lengthy scan times. The current protocol describes the first available MR technique that enables imaging of living, mammalian tissue samples at microscopic resolutions. Such data is of great importance to the understanding of how pathology-based contrast changes occurring at the microscopic level influence the content of macroscopic MR scans such as those used in the clinic. Once such an understanding is realized, diagnostic methods with greater sensitivity and accuracy can be developed, which will translate directly to earlier disease treatment, more accurate therapy monitoring and improved patient outcomes.
While the described methodology focuses on brain slice preparations, the protocol is adaptable to any excised tissue slice given that changes are made to the gas and perfusate preparations to accommodate the tissue&#39;s specific metabolic needs. Successful execution of the protocol should result in living, acute slice preparations that exhibit MR diffusion signal stability for periods up to 15.5 h. The primary advantages of the current system over other MR compatible perfusion apparatuses are its compatibility with the MR microscopy hardware required to attain higher resolution images and ability to provide constant, uninterrupted flow with carefully regulated perfusate conditions. Reduced sample throughput is a consideration with this design as only one tissue slice may be imaged at a time.

The current protocol describes a method by which users can maintain viability of acute hippocampal and cortical slice preparations during the collection of magnetic resonance microscopy data.

대사 지원 Excised, 자기 공명 현미경 중 생활 뇌 조직

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...