Diese Arbeit wurde durch nihfinanzierte R01GM080376, R35GM118139 und NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: 15-48571 an Y.E.G. und durch ein NIAID-Prädoktoranden-NRSA-Stipendium F30AI114187 an R.M.J.

HINWEIS: Alle Schritte können im allgemeinen Laborbereich ausgeführt werden.
1. Reinigung von Glasabdeckungen
<ol><li>Um eine saubere Oberfläche für die Verdunstungsablagerung kolloidaler Partikel zu schaffen, legen Sie 24 x 30 mm optische Borosilikatglasabdeckungen (0,16−0,19 mm Dicke) zur Reinigung in die gerillten Einsätze eines Coplinglas-Glasfärbeglases. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Abdecklippen aufrecht stehen und gut getrennt sind, damit alle Oberflächen während des Reinigungsvorgangs deutlich freigelegt werden.</li>
	<li>Gießen Sie genug Aceton in das Färbeglas, um die Decklippen zu bedecken, legen Sie die Abdeckung auf und beschallen Sie sie für 10 min bei 40 ° C.</li>
	<li>Gießen Sie das Aceton aus und spülen Sie die Abdecklippen aus, indem Sie das Färbeglas mit destilliertem H2O füllen und das Wasser ausgießen. Wiederholen Sie 2 weitere Male.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Aceton-Beschallung (Schritte 1.2 und 1.3) noch einmal.</li>
	<li>Gießen Sie genug 200 mM KOH in das Glas, um die Deckrutsche abzudecken und beschallen Sie abgedeckt, für 20 min bei 40 ° C. HINWEIS: Der KOH ätscht das Glas leicht.</li>
	<li>Spülen Sie die Abdecklippen mit destilliertemH2O6 mal aus.</li>
	<li>Ethanol hinzufügen, um die Deckslippen abzudecken, den Deckel hinzufügen und 10 Minuten bei 40 °C beschallen.</li>
	<li>Spülen Sie die Abdecklippen mit destilliertemH2O3 mal aus.</li>
	<li>Nehmen Sie jeden Abdeckr am Rand mit einer sanften Zette auf und trocknen Sie die Abdeckrlips mit N2-Gas. Berühren Sie nur die Kanten des Abdeckungsrutsches. Legen Sie jeden der getrockneten, gereinigten Abdecklippen in eine einzelne saubere Petrischale.</li>
</ol>2. Verdunstungsablagerung von Polystyrolperlen
<ol><li>Um die kolloidale Kristallmaske für das ZMW-Array zu erstellen, zentrifugieren Sie 50 μL mit 1 μm Durchmesser, nicht funktionalisierte Polystyrolperlen (2,5% w/v in Wasser) bei 15.000 x g,25 °C für 5 min. HINWEIS: Vor dem Pipettieren der Perlen sollte die Stammlösung kurz vorgetext werden, falls sich die Perlen auf dem Boden der Flasche abgesetzt haben.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand und lassen Sie so wenig Wasser wie möglich übrig. HINWEIS: Restwasser kann die Verdunstungseigenschaften der Ethanol-Resuspension39verändern, so dass das Entfernen einer kleinen Menge Perlen, um das gesamte Wasser zu entfernen, akzeptabel ist.</li>
	<li>Die Perlen aus Schritt 2.2 werden in 50 μL 1:400 TritonX-100:Ethanol Lösungsmittel resuspendiert. Mehrmals auf und ab pipetten, um die Perlen gründlich mit dem Lösungsmittel zu mischen. HINWEIS: TritonX-100: Ethanol-Lösungsmittel sollte nach Gebrauch mit Paraffinfolie versiegelt und einmal im Monat frisch zubereitet werden. Die Perlen neigen dazu, an den Seiten eines Kunststoffgefäßes zu haften, z. B. an einem Mikrozentrifugenröhrchen, also pipetten Sie entlang der Seiten, um sicherzustellen, dass alle Perlen wieder aufgewendet werden.</li>
	<li>Um eine Feuchtigkeitskammer für die Ablagerung einzurichten, legen Sie 6 Petrischalen mit jeweils einem Deckslip auf eine Bank in einer Linie mit leicht offenen Deckeln. Bewegen Sie in jeder Schüssel den Abdeckungsrutsch in den offenen Bereich, so dass die Abdeckungsrutsche der Umgebung ausgesetzt sind, wenn die Luftfeuchtigkeit im nächsten Schritt erhöht wird.</li>
	<li>Platzieren Sie ein Hygrometer und einen kleinen elektrischen Ventilator zentriert hinter den Petrischalen.</li>
	<li>Zeichnen Sie die beginnende relative Luftfeuchtigkeit (RH) im Labor auf. Füllen Sie ein 200 ml Becherglas mit 150−200 ml ~75 °C Wasser und legen Sie es hinter den Ventilator.</li>
	<li>Schalten Sie den Ventilator ein und bedecken Sie Petrischalen, Ventilator, Becher und Hygrometer mit einem umgekippten, transparenten Kunststoffbehälter (66 cm x 46 cm x 38 cm).</li>
	<li>Lassen Sie die relative Luftfeuchtigkeit in der Kammer auf 70-75% ansteigen, was normalerweise 5-10 Minuten dauert. HINWEIS: Wenn der rh im Umgebungslabor niedrig ist (unter ~ 50%), lassen Sie die Kammer einen höheren RH erreichen, aber nicht höher als 80%, um den Feuchtigkeitsverlust während der Ablagerung auszugleichen (siehe unten).</li>
	<li>Wenn der relative Stand 70-75% erreicht, zeichnen Sie die relative Luftfeuchtigkeit auf und heben Sie den Kunststoffbehälter leicht an, um schnell Abdeckungen auf die Petrischalen zu legen, wodurch eine Überbenetzung der Abdecklippen verhindert wird. HINWEIS: Die Temperatur in der Kammer ist aufgrund der Befeuchtung etwas wärmer als die Raumtemperatur, typischerweise 25-26 ° C. Wenn Feuchtigkeit auf den Abdecklippen sichtbar ist, sind die Glasoberflächen zu nass. Ein kommerzielles Handschuhfach kann diesen Teil des Protokolls vereinfachen.</li>
	<li>Lassen Sie die relative Luftfeuchtigkeit in der Kammer weiterhin auf 85% steigen. Zeichnen Sie an diesem Punkt die relative Luftfeuchtigkeit in der Feuchtigkeitskammer auf und pipetetten Sie 5 μL der Perlensuspension auf die Mitte jedes Abdecks.</li>
	<li>Schließen Sie die Kammer und die Petrischalen nach jeder Ablagerung, um den Feuchtigkeitsverlust zu minimieren. Ziel ist es, alle 6 Ablagerungen innerhalb von 2 Minuten zu beenden.</li>
	<li>Notieren Sie die relative Luftfeuchtigkeit in der Kammer nach der Ablagerung. HINWEIS: Die relative Luftfeuchtigkeit nach der Abscheidung hilft zu messen, wie schnell feuchtigkeit während der Ablagerung verloren ging, was von den Umgebungsbedingungen im Labor abhängt. Für einen typischen erfolgreichen Lauf beginnt die Kammer vor der Ablagerung bei 85% RH und endet nach der Ablagerung bei 70-75% RH.</li>
	<li>Die Perlentröpfchen verteilen lassen und 5 min trocknen lassen. HINWEIS: Wenn die kolloidalen Kristalle viele Löcher oder mehrschichtige Regionen haben, war die Kammer wahrscheinlich zu feucht bzw. trocken. Stellen Sie die relative Luftfeuchtigkeit ein, bei der die Petrischalen geschlossen und die Ablagerungen begonnen werden sollen (siehe Abschnitt Ergebnisse für weitere Diskussionen zur Optimierung).</li>
</ol>3. Perlenglühen zur Reduzierung der Porengröße in der kolloidalen Kristallschablone
<ol><li>Um eine gleichmäßige Temperaturoberfläche für das Glühen der Polystyrolperlen zu schaffen, die die Zwischenkugel-Zwischenpunkte verengt und die Ecken der Zwischenabstande rundet, legen Sie eine flache, gefräste Aluminiumplatte auf eine Standard-Keramik-Heizplatte.</li>
	<li>Stellen Sie die Temperatur der Heizplatte auf 107 °C ein, die Glasübergangstemperatur von Polystyrol40. HINWEIS: Um eine stabile und genaue Temperatur zu erhalten, wurde eine Thermoelementsonde in einem 2-3 mm breiten und 4-5 mm tiefen Loch in der Aluminiumplatte gehalten.</li>
	<li>Legen Sie einen Abdeckrlip mit der Perlenschablone auf die heiße Aluminiumplatte und glühen Sie für 20 s (siehe Diskussionsabschnitt für die Erklärung der Schmelzzeit).</li>
	<li>Entfernen Sie nach dem Erhitzen den Deckdeckel von der Aluminiumplatte und legen Sie ihn sofort auf eine andere Aluminiumoberfläche mit Raumtemperatur, um sie zu kühlen. HINWEIS: Es ist hilfreich, entweder die Abdecklippen leicht über den Rand der Platte hängen zu lassen oder flache Kanäle (siehe begleitendes Video) in die Platte zu fräsen, um die Aufnahme der Abdecklippen zu erleichtern.</li>
</ol>4. Nanofabrikation von Aluminium-Zero-Mode-Wellenleitern mit der kolloidalen Kristallschablone
<ol><li>Mit thermischer oder Elektronenstrahl-Verdunstungsabscheidung lagern Sie 300 nm Kupfer bei 2 Å/s über die kolloidale Kristallschablone ab, um Pfosten in den Zwischenablagen zwischen den Perlen zu erzeugen.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssiges Metall auf den Perlen, indem Sie die Oberfläche vorsichtig mit Klebeband drücken. Ziehen Sie das Klebeband langsam ab, um das Metall abzuziehen. HINWEIS: Einige kleine Flecken von reflektierendem überschüssigem Metall können nach dem Bandzug verbleiben, und diese können oft durch einen Strom vonN2-Gas entfernt werden. Wenn nach dem Bandzug erhebliche Flecken von reflektierendem überschüssigem Metall verbleiben, versuchen Sie, die Schablonen 2 Stunden lang in Toluol einzuweichen, um die Polystyrolperlen teilweise aufzulösen. Waschen Sie die Abdecklappen mit destilliertem Wasser, trocknen Sie sie mitN 2und wiederholen Sie den Bandzug. Das zusätzliche Einweichen sollte die Perlen nicht vollständig auflösen, da die Perlen dazu beitragen, die Pfosten vor Beschädigungen während des Bandzugs zu schützen.</li>
	<li>Um die Polystyrolperlen aufzulösen, legen Sie die Perlenschablonen in Toluol und weichen Sie sie über Nacht ein. ACHTUNG: Toluoldämpfe können giftig sein. Arbeiten Sie mit Toluol unter einer gut belüfteten Kapuze und tragen Sie persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe, Schutzbrille und laborbeschichtet. Toluol sollte in belüfteten Schränken gelagert werden, die für brennbare Flüssigkeiten bestimmt sind.</li>
	<li>Nach der Toluol-Inkubation spülen Sie die Schablonen einmal mit Chloroform und zweimal mit Ethanol ab. Behandeln Sie an dieser Stelle vorsichtig die Abdeckungen, da die empfindlichen 200-300 nm hohen Metallpfosten jetzt freigelegt sind. Trocknen Sie die Schablonen mitN 2 und entfernen Sie Restpolymere und Verunreinigungen in einem Sauerstoffplasmareiniger für 30 min. ACHTUNG: Chloroforme Dämpfe können giftig sein. Arbeiten Sie mit Chloroform unter einer gut belüfteten Kapuze und tragen Sie persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe, Schutzbrille und einen Laborkittel. Chloroform sollte in belüfteten Schränken fern von anderen brennbaren Lösungsmitteln gelagert werden.</li>
	<li>Mit thermischer oder Elektronenstrahl-Verdunstungsabscheidung 3 nm einer Titanadhäsionsschicht bei 1 Å/s abscheiden, gefolgt von 100−150 nm Aluminium bei 4 Å/s um und auf den Kupferpfosten. HINWEIS: Man kann eine dickere Verkleidung verwenden, um tiefere Führungen und eine bessere Dämpfung der Hintergrundfluoreszenz zu erhalten, aber dies verringert auch die Ausbeute nach dem Freilegen und Auflösen der Pfosten im nächsten Schritt (siehe Diskussionsabschnitt).</li>
	<li>Um die Metallpfosten aufzulösen, weichen Sie die Abdecklippen in Kupferätzmittel (Zitronensäure-basiert; Materialtabelle) für 2 h. ACHTUNG: Metallätzen kann Hautverbrennungen verursachen. Arbeiten Sie mit Ätzmitteln unter einer gut belüfteten Motorhaube und tragen Sie Schutzausrüstung. Waschen Sie die Hände nach der Handhabung gründlich. Metallätzmittel sollten in belüfteten Schränken gelagert werden, die für korrosive Flüssigkeiten bestimmt sind.</li>
	<li>Spülen Sie die Deckzettel mit destilliertem Wasser ab, trocknen Sie sie mit N2und polieren Sie die Oberfläche der Metallverkleidung vorsichtig mit Linsenpapier ab, um alle Pfosten freizulegen, die noch mit der Verkleidung bedeckt sind. Die Abdecks für weitere 2 h wieder in Kupferätzung geben, dann erneut mit destilliertem Wasser abspülen und mitN2 trocknen. HINWEIS: ZMW-Objektträger sollten in abgedeckten, sauberen Petrischalen aufbewahrt werden, um sie frei von Verunreinigungen zu halten.</li>
</ol>5. Nanofabrikation von Gold-Nullmodus-Wellenleitern mit der kolloidalen Kristallschablone
HINWEIS: Die Methode zur Herstellung von Gold-ZMWs (Ergänzende Abbildung 1), die das Protokoll zur Herstellung von Aluminium-ZMWs widerspiegelt, wird in diesem Abschnitt bereitgestellt.
<ol><li>Mit thermischer oder Elektronenstrahlverdunstungsabscheidung 3 nm einer Titanadhäsionsschicht bei 1 Å/s abscheiden, gefolgt von 300 nm Aluminium bei 4 Å/s.</li>
	<li>Entfernen Sie überschüssiges Metall auf den Perlen, indem Sie die Oberfläche vorsichtig mit Klebeband drücken. Ziehen Sie das Klebeband langsam ab, um das Metall abzuziehen.</li>
	<li>Um die Polystyrolperlen aufzulösen, legen Sie die Perlenschablonen in Toluol und weichen Sie sie über Nacht ein.</li>
	<li>Nach der Toluol-Inkubation spülen Sie die Schablonen einmal mit Chloroform und zweimal mit Ethanol ab. Trocknen Sie die Schablonen mitN 2 und entfernen Sie reste Polymerverunreinigungen in einem Sauerstoffplasmareiniger für 30 min.</li>
	<li>Mit thermischer oder Elektronenstrahlverdunstungsabscheidung lagern Sie 100-150 nm Gold bei 5 Å / s um und auf den Aluminiumpfosten ab.</li>
	<li>Um die Metallpfosten aufzulösen, weichen Sie die Abdeckel in Aluminiumätzmittel (auf Phosphorsäurebasis; Materialtabelle) für 1 h.</li>
	<li>Spülen Sie die Deckzettel mit destilliertem Wasser ab, trocknen Sie sie mit N2und polieren Sie die Oberfläche der Metallverkleidung vorsichtig mit Linsenpapier ab, um alle Pfosten freizulegen, die noch mit der Verkleidung bedeckt sind. Legen Sie die Abdeckel für 1 h wieder in Aluminiumätzen, dann erneut mit destilliertem Wasser abspülen und mitN2 trocknen. HINWEIS: ZMW-Dias sollten in abgedeckten, sauberen Petrischalen aufbewahrt werden.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Für die kolloidale Selbstorganisation (Protokollabschnitt 2) beschleunigt die Verwendung von Ethanol anstelle von Wasser als Suspensionslösungsmittel den Verdampfungsprozess, so dass die Schablonen in 2−3 min nach der Abscheidung fertig sind und nicht wie bei den vorherigen Methoden48,49 in 1−2h. Das hier vorgestellte Verdunstungssedimentationsprotokoll ist auch einfacher als frühere Sedimentationsprotokolle, die die Kontrolle von Oberflächenneigung, Temp...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.
Figure 3 was updated from:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.

Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Einzelmolekültechniken wie Einzelmolekül-Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (smFRET) oder Einzelmolekül-Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) sind leistungsfähige Werkzeuge für die molekulare Biophysik, die die Untersuchung dynamischer Bewegungen, Konformationen und Wechselwirkungen einzelner Biomoleküle in Prozessen wie Transkription1,2,3, Translation4,5,6und vielen anderen ermöglichen7. Für smFRET ist die TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) eine gängige Methode, da viele angebundene Moleküle im Laufe der Zeit verfolgt werden können und die von TIR erzeugte evaneszente Welle auf einen 100-200-nm-Bereich neben dem Coverslip8beschränkt ist. Trotz dieser Beschränkung des Anregungsvolumens müssen jedoch noch interessante Fluorophore in pM- oder nM-Bereiche verdünnt werden, um Einzelmolekülsignale oberhalb der Hintergrundfluoreszenz9zu detektieren. Da die Michaelis-Menten-Konstanten zellulärer Enzyme typischerweise im Bereich von μM bis mM10 liegen,sind biochemische Reaktionen in Einzelmolekülstudien in der Regel viel langsamer als die in der Zelle. Zum Beispiel findet die Proteinsynthese bei 15-20 Aminosäuren pro Sekunde in E. coli11,12statt, während die meisten prokaryotischen Ribosomen in smFRET-Experimenten bei 0,1-1 Aminosäure pro Sekunde13übersetzen. In der Proteinsynthese zeigten Kristallstrukturen und smFRET an festgefahrenen Ribosomen, dass Transfer-RNAs (tRNAs) vor der tRNA-mRNA-Translokation Schritt14,15zwischen "hybriden" und "klassischen" Zuständen schwanken. Wenn jedoch physiologische Konzentrationen des Translokations-GTPase-Faktors EF-G vorhanden waren, wurde in smFRET 6 eine andere Konformation beobachtet, die zwischen dem hybriden und dem klassischen Zustandliegt. Die Untersuchung dynamischer molekularer Prozesse mit ähnlichen Geschwindigkeiten und Konzentrationen wie in der Zelle ist wichtig, bleibt aber eine technische Herausforderung.
Eine Strategie zur Erhöhung der fluoreszierenden Substratkonzentration ist die Verwendung metallbasierter, subsichtbarer Wellenlängenöffnungen, sogenannte Zero Mode Waveguides (ZMWs), um begrenzte Anregungsfelder zu erzeugen, die selektiv Biomoleküle anregen, die innerhalb der Aperturen lokalisiert sind16 (Abbildung 1). Die Öffnungen sind typischerweise 100−200 nm im Durchmesser und 100−150 nm in der Tiefe17. Oberhalb einer Cutoff-Wellenlänge bezogen auf die Größe und Form der Brunnen (λc ≈ 2,3-facher Durchmesser für kreisförmige Wellenleiter mit Wasser als dielektrischem Medium18)sind im Wellenleiter keine Ausbreitungsmoden erlaubt, daher der Begriff Nullmodus-Wellenleiter. Ein oszillierendes elektromagnetisches Feld, eine evaneszente Welle, exponentiell zerfallende Intensität, tunnelt jedoch immer noch eine kurze Strecke in den Wellenleiter18,19. Obwohl sie den evaneszenten TIR-Wellen ähneln, haben ZMW-evaneszente Wellen eine kürzere Zerfallskonstante, was zu einem effektiven Anregungsbereich von 10-30 nm innerhalb des Wellenleiters führt. Bei mikromolaren Konzentrationen fluoreszierend markierter Liganden sind nur ein oder wenige Moleküle gleichzeitig im Anregungsgebiet vorhanden. Diese Einschränkung des Anregungsvolumens und die daraus resultierende Reduktion der Hintergrundfluoreszenz ermöglicht die Fluoreszenzbildgebung einzelner Moleküle in biologisch relevanten Konzentrationen. Dies wurde auf viele Systeme20angewendet, einschließlich FCS-Messungen der Einzelproteindiffusion21,Einzelmolekül-FRET-Messungen von niedrigaffinen Liganden-Protein-22 und Protein-Protein-Interaktionen23und spektro-elektrochemische Messungen von einzelnen molekularen Umsatzereignissen24.
ZMWs wurden durch direktes Strukturieren einer Metallschicht mit Ionenstrahlfräsen25,26 oder Elektronenstrahllithographie (EBL)hergestellt,gefolgt von Plasmaätzen16,27. Diese maskenlosen Lithographiemethoden erzeugen Wellenleiter in Serie und erfordern in der Regel Zugang zu spezialisierten Nanofabrikationsanlagen, was eine weit verbreitete Einführung der ZMW-Technologie verhindert. Eine andere Methode, ultraviolette Nanoimprint-Lithographie-Lift-off28,verwendet eine Quarz-Diaform, um eine inverse ZMW-Schablone wie einen Stempel auf einen Widerstandsfilm zu drücken. Während diese Methode stromlinienförmiger ist, benötigt sie immer noch EBL für die Herstellung der Quarzform. Dieser Artikel stellt das Protokoll für eine einfache und kostengünstige vorgefertigte Herstellungsmethode vor, die kein EBL- oder Ionenstrahlfräsen erfordert und auf der engen Verpackung von Nanosphären basiert, um eine lithographische Maske zu bilden.
Die Nanosphären- oder "natürliche" Lithographie, die erstmals 1982 von Deckman und Dunsmuir29,30vorgeschlagen wurde, verwendet die Selbstorganisation monodisperser kolloidaler Partikel, die von Dutzenden von Nanometern bis zu Dutzenden von Mikrometern31reichen, um Vorlagen für die Oberflächenstrukturierung durch Ätzen und / oder Abscheiden von Materialien zu erstellen. Die zweidimensionalen (2D) oder dreidimensionalen (3D) erweiterten periodischen Anordnungen kolloidaler Partikel, die als kolloidale Kristalle bezeichnet werden, zeichnen sich durch eine helle Iriseszenz aus Streuung und Beugungaus 32aus. Obwohl diese Maskierungsmethode weniger weit verbreitet ist als Elektronenstrahl- oder Photolithographie, ist sie einfach, kostengünstig und leicht zu verkleinern, um Feature-Größen unter 100 nm zu erzeugen.
Die Selbstorganisation kolloidaler Partikel bestimmt den Erfolg der Verwendung kolloidaler Kristalle als Masken für die Oberflächenstrukturierung. Wenn die Größe und Form der Partikel homogen sind, können kolloidale Partikel leicht mit hexagonaler Packung selbst zusammengesetzt werden, angetrieben durch entropische Erschöpfung33. Die Wasserverdampfung nach der Tropfenbeschichtung ist ein effektiver Weg, um die kolloidalen Partikel zu sedimentieren, obwohl andere Methoden Tauchbeschichtung34, Spinbeschichtung35, elektrophoretische Abscheidung36und Konsolidierung an einer Luft-Wasser-Grenzfläche37umfassen. Das unten vorgestellte Protokoll basiert auf der Verdunstungssedimentationsmethode, die am einfachsten zu implementieren war. Die dreieckigen Zwischenstellen zwischen dicht gepackten Polystyrolperlen bilden Öffnungen, in denen ein Opfermetall plattiert wird, wodurch Pfosten entstehen (Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 1). Kurzes Glühen der Perlen vor diesem Schritt passt die Form und den Durchmesser dieser Pfosten an. Die Perlen werden entfernt, eine letzte Metallschicht wird um die Pfosten herum abgelagert und dann werden die Pfosten entfernt. Nach den beiden Metallabscheidungsschritten auf die kolloidale Nanomaske, der Entfernung der Zwischenpfosten und der oberflächenchemischen Modifikation zur Passivierung und Anbindeung sind die ZMW-Arrays für die Einzelmolekülbildgebung einsatzbereit. Eine weitergehende Charakterisierung der optischen Eigenschaften des ZMW nach der Herstellung findet sich in einem begleitenden Artikel38. Neben einem thermischen Verdampfer zur Dampfabscheidung der Metalle sind keine Spezialwerkzeuge erforderlich.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:667px;" width="668">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1. Glass Coverslip Cleaning</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Acetone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coplin glass staining jar</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-817</td>
			<td>Staining jar with 8 grooves and molded glass cover</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:103px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48404-467</td>
			<td>24 mm x 30 mm (No.1&#189;, Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">KOH</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R80115TS</td>
			<td>100 mm diameter, 15 mm deep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sonicator</td>
			<td style="width:103px;">Branson</td>
			<td style="width:119px;">Z245143</td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 5510</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Clear storage container</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-110-8222</td>
			<td>26 x 18 x 15 in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Desk fan</td>
			<td style="width:103px;">O2Cool</td>
			<td style="width:119px;">FD05001A</td>
			<td>Any small desk (~5 in.) fan will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glass beaker</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-555-25B</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Humidity meter</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-661-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21-402-903</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polystyrene microspheres</td>
			<td style="width:103px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">18602-15</td>
			<td>1.00 &#181;m diameter, non-functionalized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X-100 deturgent</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Aluminum plate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AA11062RY</td>
			<td>Customized in-house to 14 cm x 14 cm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Ceramic hotplate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">HP88857100</td>
			<td>13 x 8.2 x 3.8 in.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">38615K71</td>
			<td>Read temperature with thermocouple probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thermocouple probe</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">9251T93</td>
			<td>Type K, surface probe</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">Type A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAL40QXHB</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Chloroform</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">49-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMCU40QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gold pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAUXX40G</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lens paper</td>
			<td style="width:103px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:103px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:119px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:103px;">Staples</td>
			<td style="width:119px;">MMM119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Thin film deposition system</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">PVD-75</td>
			<td>Tabletop thermal evaporation system will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Titanium pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMTI45QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Toluene</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">244511</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Representative Results</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">COMSOL Multiphysics Modeling Software</td>
			<td>COMSOL, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dual View spectral splitter</td>
			<td style="width:103px;">Photometrics, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy

In der Einzelmolekülfluoreszenzenzymologie begrenzt die Hintergrundfluoreszenz von markierten Substraten in Lösung die Fluorophorkonzentration oft auf pico- bis nanomolare Bereiche, mehrere Größenordnungen weniger als viele physiologische Ligandenkonzentrationen. Optische Nanostrukturen, sogenannte Zero Mode Waveguides (ZMWs), bei denen es sich um Aperturen mit einem Durchmesser von 100-200 nm handelt, die in einem dünnen leitenden Metall wie Aluminium oder Gold hergestellt werden, ermöglichen die Abbildung einzelner Moleküle bei mikromolaren Konzentrationen von Fluorophoren, indem sie die Anregung des sichtbaren Lichts auf zeptoliterische effektive Volumina beschränken. Der Bedarf an teuren und spezialisierten Nanofabrikationsgeräten hat jedoch die weit verbreitete Verwendung von ZMWs ausgeschlossen. Typischerweise werden Nanostrukturen wie ZMWs durch direktes Schreiben mit Elektronenstrahllithographie erhalten, die sequenziell und langsam ist. Hier wird die kolloidale oder Nanosphärenlithographie als alternative Strategie verwendet, um Masken im Nanometerbereich für die Wellenleiterherstellung herzustellen. Dieser Bericht beschreibt den Ansatz ausführlich mit praktischen Überlegungen für jede Phase. Das Verfahren ermöglicht es, Tausende von Aluminium- oder Gold-ZMWs parallel mit endgültigen Wellenleiterdurchmessern und Tiefen von 100-200 nm zu machen. Es werden nur gängige Laborgeräte und ein thermischer Verdampfer für die Metallabscheidung benötigt. Indem ZMWs für die biochemische Gemeinschaft zugänglicher gemacht werden, kann diese Methode die Untersuchung molekularer Prozesse bei zellulären Konzentrationen und Raten erleichtern.

Die Selbstorganisation der kolloidalen Polystyrolpartikel durch Verdunstungssedimentation (Schritte 2.1−2.13) kann zu einer Reihe von Ergebnissen führen, da sie eine Kontrolle der Lösungsmittelverdampfungsrate erfordert. Da die Ablagerungen jedoch schnell sind (10-15 min pro Runde), kann das Verfahren schnell für unterschiedliche Umgebungsbedingungen im Labor optimiert werden. Abbildung 3A zeigt eine wohlgeformte kolloidale Schablone nach Ablagerung und Verdampfung. Makroskopisch ist de...

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Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Hier wird eine Nanosphärenlithographiemethode zur parallelen Herstellung von Nullmoduswellenleitern beschrieben, bei denen es sich um Arrays von Nanoaperturen in einem metallbeschichteten Glasmikroskopie-Coverlip für die Einzelmolekülbildgebung bei nano- bis mikromolaren Konzentrationen von Fluorophoren handelt. Die Methode nutzt die Kolloidalkristall-Selbstorganisation, um eine Hohlleiterschablone zu erstellen.

Herstellung von Zero Mode Waveguides für die hochkonzentrierte Einzelmolekülmikroskopie

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

fabrication-zero-mode-waveguides-for-high-concentration-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.8K Aufrufe.  University of Pennsylvania. Hier wird eine Nanosphärenlithographiemethode zur parallelen Herstellung von Nullmoduswellenleitern beschrieben, bei denen es sich um Arrays von Nanoaperturen in einem metallbeschichteten Glasmikroskopie-Coverlip für die Einzelmolekülbildgebung bei nano- bis mikromolaren Konzentrationen von Fluorophoren handelt. Die Methode nutzt die Kolloidalkristall-Selbstorganisation, um eine Hohlleiterschablone zu erstellen.

Serie: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Bühne Fabrication für Correlated Light / Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Forschung

Biotechnik

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Fabrication of Carbon Nanotube High-Frequency Nanoelectronic Biosensor for Sensing in High Ionic Strength Solutions

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them good candidates for high sensitivity biosensors. When a charged molecule binds to such a sensor surface, it alters the carrier density5 in the sensor, resulting in changes in its DC conductance. However, in an ionic solution a charged surface also attracts counter-ions from the solution, forming an electrical double layer (EDL). This EDL effectively screens off the charge, and in physiologically relevant conditions ~100 millimolar (mM), the characteristic charge screening length (Debye length) is less than a nanometer (nm). Thus, in high ionic strength solutions, charge based (DC) detection is fundamentally impeded6-8.
We overcome charge screening effects by detecting molecular dipoles rather than charges at high frequency, by operating carbon nanotube field effect transistors as high frequency mixers9-11. At high frequencies, the AC drive force can no longer overcome the solution drag and the ions in solution do not have sufficient time to form the EDL. Further, frequency mixing technique allows us to operate at frequencies high enough to overcome ionic screening, and yet detect the sensing signals at lower frequencies11-12. Also, the high transconductance of SWNT transistors provides an internal gain for the sensing signal, which obviates the need for external signal amplifier.
Here, we describe the protocol to (a) fabricate SWNT transistors, (b) functionalize biomolecules to the nanotube13, (c) design and stamp a poly-dimethylsiloxane (PDMS) micro-fluidic chamber14 onto the device, and (d) carry out high frequency sensing in different ionic strength solutions11.

We describe the device fabrication and measurement protocol for carbon nanotube based high frequency biosensors. The high frequency sensing technique mitigates the fundamental ionic (Debye) screening effect and allows nanotube biosensor to be operated in high ionic strength solutions where conventional electronic biosensors fail. Our technology provides a unique platform for point-of-care (POC) electronic biosensors operating in physiologically relevant conditions.

Herstellung von Kohlenstoff-Nanoröhrchen Hochfrequenztechnik Nanoelectronic Biosensor für Sensing in hoher Ionenstärke Lösungen

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using sonication, mechanical agitation, microfluidic devices, or homogenization. Recently, lipid-based oxygen microbubbles (LOMs) have been designed to deliver oxygen intravenously during medical emergencies, reversing life-threatening hypoxemia, and preventing subsequent organ injury, cardiac arrest, and death. We present methods for scaled-up production of highly oxygenated microbubbles using a closed-loop high-shear homogenizer. The process can produce 2 L of concentrated LOMs (90% by volume) in 90 min. Resulting bubbles have a mean diameter of ~2 &#956;m, and a rheologic profile consistent with that of blood when diluted to 60 volume %. This technique produces LOMs in high capacity and with high oxygen purity, suggesting that this technique may be useful for translational research labs.

We describe methods for the manufacture of large volumes of lipid-based oxygen microbubbles (LOMs) designed for intravenous oxygen delivery using high-shear homogenization and serial concentration.

Herstellung von konzentrierten, Lipid-basierte Sauerstoffmikroblasen-Emulsionen von High-Shear-Homogenisierung und Serien Konzentration

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Markierungsfreie Einzelmoleküldetektion Mit Mikrotoroid optischen Resonatoren

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic resonance (MR) microscopy data. While it is possible to perform MR collections on living, excised mammalian tissue, such experiments have traditionally been constrained by resolution limits and are thus incapable of visualizing tissue microstructure. Conversely, MR protocols that did achieve microscopic image resolution required the use of fixed samples to accommodate the need for static, unchanging conditions over lengthy scan times. The current protocol describes the first available MR technique that enables imaging of living, mammalian tissue samples at microscopic resolutions. Such data is of great importance to the understanding of how pathology-based contrast changes occurring at the microscopic level influence the content of macroscopic MR scans such as those used in the clinic. Once such an understanding is realized, diagnostic methods with greater sensitivity and accuracy can be developed, which will translate directly to earlier disease treatment, more accurate therapy monitoring and improved patient outcomes.
While the described methodology focuses on brain slice preparations, the protocol is adaptable to any excised tissue slice given that changes are made to the gas and perfusate preparations to accommodate the tissue&#39;s specific metabolic needs. Successful execution of the protocol should result in living, acute slice preparations that exhibit MR diffusion signal stability for periods up to 15.5 h. The primary advantages of the current system over other MR compatible perfusion apparatuses are its compatibility with the MR microscopy hardware required to attain higher resolution images and ability to provide constant, uninterrupted flow with carefully regulated perfusate conditions. Reduced sample throughput is a consideration with this design as only one tissue slice may be imaged at a time.

The current protocol describes a method by which users can maintain viability of acute hippocampal and cortical slice preparations during the collection of magnetic resonance microscopy data.

Metabolische Unterstützung der herausgeschnitten, lebendes Gehirn Gewebe während der Magnet-Resonanz-Mikroskopie-Akquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...