Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01GM080376, R35GM118139 e NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: da 15-48571 a Y.E.G., e da una borsa di studio NRSA pre-dottorato NIAID da F30AI114187 a R.M.J.

NOTA: tutti i passaggi possono essere completati nello spazio generale del laboratorio.
1. Pulizia delle labbra con coperture in vetro
<ol><li>Per fornire una superficie pulita per la deposizione evaporativa di particelle colloidali, posizionare 24 x 30 mm di rivestimenti in vetro borosilicato ottico (spessore 0,16−0,19 mm) all'interno degli inserti scanalati di un barattolo di colorazione in vetro coplin per la pulizia. NOTA: Assicurarsi che i copriparsi siano in posizione verticale e siano ben separati in modo che tutte le superfici siano chiaramente esposte durante il processo di pulizia.</li>
	<li>Versare abbastanza acetone nel barattolo di colorazione per coprire le copertine, posizionare il coperchio e sonicare per 10 minuti a 40 °C.</li>
	<li>Versare l'acetone e sciacquare le copertine riempiendo il barattolo di colorazione con H2O distillato e versando l'acqua. Ripeti altre 2 volte.</li>
	<li>Ripetere ancora una volta la sonicazione dell'acetone (passaggi 1.2 e 1.3).</li>
	<li>Versare abbastanza KOH da 200 mM nel barattolo per coprire le coverlips e sonicare, coperto, per 20 min a 40 °C. NOTA: Il KOH intasa leggermente il vetro.</li>
	<li>Risciacquare le coverlips con H distillato2O 6 volte.</li>
	<li>Aggiungere l'etanolo per coprire i copricapo, aggiungere il coperchio e sonicare per 10 minuti a 40 °C.</li>
	<li>Risciacquare le coverlips con H distillato2O 3 volte.</li>
	<li>Raccogliere ogni coverlip sul bordo con forcep delicate e asciugare i copricapo con gas N2. Toccare solo i bordi del coverslip. Posizionare ciascuna delle coverlip essiccate e pulite in una singola piastra di Petri pulita.</li>
</ol>2. Deposizione evaporativa di perline di polistirolo
<ol><li>Per creare la maschera di cristallo colloidale per l'array ZMW, centrifugare 50 μL di 1 μm di diametro, perline di polistirolo non funzionalizzate (2,5% w/v in acqua) a 15.000 x g,25 °C per 5 min. NOTA: Prima di pipeggiare le perline, la soluzione stock deve essere brevemente vortice nel caso in cui le perline si siano depositate sul fondo della bottiglia.</li>
	<li>Scartare il supernatante, lasciando meno acqua rimasta possibile. NOTA: L'acqua residua può cambiare le proprietà di evaporazione della resopensione dell'etanolo39,quindi è accettabile la rimozione di una piccola quantità di perline per rimuovere tutta l'acqua.</li>
	<li>Rimossare le perline dal passo 2.2 in 50 μL di 1:400 TritonX-100:etanolo solvente. Pipettare su e giù più volte per mescolare accuratamente le perline con il solvente. NOTA: TritonX-100:etanolo solvente deve essere sigillato con pellicola di paraffina dopo l'uso e preparato fresco una volta al mese. Le perline tendono ad aderire ai lati di un recipiente di plastica, come un tubo di microcentrifugo, quindi pipetta lungo i lati per garantire che tutte le perline vengano rimescolate.</li>
	<li>Per impostare una camera di umidità per la deposizione, posizionare 6 piastre di Petri, ognuna con un copripasto, su una panca in linea con coperchi lasciati leggermente socchiusa. In ogni piatto, spostare il coverslip nella regione aperta in modo che i copriparsi siano esposti all'ambiente quando l'umidità aumenta nel passaggio successivo.</li>
	<li>Posizionare un igrometro e un piccolo ventilatore elettrico centrato dietro le piastre di Petri.</li>
	<li>Registrare l'umidità relativa iniziale (RH) in laboratorio. Riempire un becher da 200 mL con 150−200 mL di ~75 °C di acqua e posizionarlo dietro il ventilatore.</li>
	<li>Accendere il ventilatore e coprire le piastre di Petri, il ventilatore, il becher e l'igrometro con un contenitore di stoccaggio in plastica rovesciato e trasparente (66 cm x 46 cm x 38 cm).</li>
	<li>Lasciare che l'RH nella camera sali al 70−75%, che in genere richiede 5−10 min. NOTA: Se il laboratorio ambientale RH è basso (inferiore a ~50%), lasciare che la camera raggiunga un RH più alto, ma non superiore all'80%, per compensare la perdita di umidità durante la deposizione (vedi sotto).</li>
	<li>Quando l'RH raggiunge il 70−75%, registrare la RH e sollevare leggermente il contenitore di plastica per posizionare rapidamente le coperture sulle piastre di Petri, il che impedisce l'inumuramento esortibile dei copripavimenti. NOTA: La temperatura nella camera sarà leggermente più calda della temperatura ambiente, tipicamente 25−26 °C, a causa dell'umidificazione. Se l'umidità è visibile sui coprispasmi, le superfici di vetro sono troppo bagnate. Una scatola portaoggetti commerciale potrebbe semplificare questa parte del protocollo.</li>
	<li>Lascia che l'RH nella camera continui a salire all'85%. A quel punto, registrare l'RH nella camera di umidità e pipettare 5 μL della sospensione del tallone al centro di ogni coverlip.</li>
	<li>Chiudere la camera e le piastre di Petri dopo ogni deposizione per ridurre al minimo la perdita di umidità. Mira a finire tutte e 6 le deposizioni entro 2 minuti.</li>
	<li>Registrare l'RH nella camera dopo la deposizione. NOTA: La deposizione rh dopo la deposizione aiuterà a misurare la velocità con cui l'umidità è stata persa durante la deposizione, che dipende dalle condizioni del laboratorio ambientale. Per una tipica corsa di successo, la camera inizierà all'85% di RH prima della deposizione e terminerà al 70−75% di RH dopo la deposizione.</li>
	<li>Lasciare che le goccioline di perline si diffondano e si asciughino per 5 minuti. NOTA: Se i cristalli colloidali hanno molti fori o regioni multistrato, la camera era probabilmente troppo umida o asciutta, rispettivamente. Regolare l'umidità relativa alla quale chiudere le piastre di Petri e iniziare le deposizioni (vedi la sezione risultati per ulteriori discussioni sull'ottimizzazione).</li>
</ol>3. Ricottura delle perline per ridurre le dimensioni dei pori nel modello di cristallo colloidale
<ol><li>Per fornire una superficie di temperatura uniforme per la ricottura delle perline di polistirolo, che restringe gli interstizi tra perline e arrotonda gli angoli degli interstizi, posizionare una piastra di alluminio piatta e fresata sopra una piastra calda in ceramica standard.</li>
	<li>Impostare la temperatura della piastra calda su 107 °C, la temperatura di transizione del vetro del polistirolo40. NOTA: Per ottenere una temperatura stabile e accurata, una sonda termocopia è stata tenuta in un foro largo 2−3 mm e profondo 4−5 mm nella piastra di alluminio.</li>
	<li>Posizionare un coverslip contenente il modello di perline sulla piastra di alluminio caldo e ricottura per 20 s (vedere la sezione discussione per la spiegazione del tempo di fusione).</li>
	<li>Dopo il riscaldamento, rimuovere il coverslip dalla piastra di alluminio e posizionarlo prontamente su un'altra superficie in alluminio a temperatura ambiente per raffreddarlo. NOTA: È utile che i copripavimenti pendino leggermente sopra il bordo della piastra o mulino canali poco profondi (vedi il video di accompagnamento) nella piastra per facilitare il ritiro dei copripavimenti.</li>
</ol>4. Nanofabbricazione di guide d'onda in modalità zero in alluminio utilizzando il modello di cristallo colloidale
<ol><li>Utilizzando la deposizione evaporativa a fascio termico o elettrone, depositare 300 nm di rame a 2 Å/s sul modello di cristallo colloidale per generare pali negli interstizi tra le perline.</li>
	<li>Rimuovere il metallo in eccesso sopra le perline premendo delicatamente la superficie con del nastro adesivo. Sbucciare lentamente il nastro per estrarre il metallo. NOTA: Alcune piccole macchie di metallo in eccesso riflettente possono rimanere dopo l'estrazione del nastro, e queste possono spesso essere rimosse da un flusso di gas N2. Se dopo l'accostamento del nastro rimangono macchie sostanziali di metallo in eccesso riflettente, provare a immergere i modelli in toluene per 2 ore per sciogliere parzialmente le perline di polistirolo. Lavare le coverlips con acqua distillata, asciugare con N2e ripetere l'estratto del nastro. L'ammollo aggiuntivo non deve sciogliere completamente le perline, poiché le perline aiutano a proteggere i pali dai danni durante l'esercista del nastro.</li>
	<li>Per sciogliere le perline di polistirolo, posizionare i modelli di perline in toluene e immergersi durante la notte. ATTENZIONE: I fumi di toluene possono essere tossici. Lavora con il toluene sotto un cappuccio ben ventilato e indossa dispositivi di protezione individuale, tra cui guanti, occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio. Il toluene deve essere conservato in armadi ventilati designati per liquidi infiammabili.</li>
	<li>Dopo l'incubazione del toluene, sciacquare i modelli una volta con cloroformio e due volte con etanolo. Maneggiare accuratamente le coperture a questo punto perché i delicati pali metallici alti 200−300 nm sono ora esposti. Asciugare i modelli con N2 e rimuovere polimeri e contaminanti residui in un detergente al plasma di ossigeno per 30 minuti. ATTENZIONE: I fumi cloroformi possono essere tossici. Lavorare con il cloroformio sotto un cappuccio ben ventilato e indossare dispositivi di protezione individuale, tra cui guanti, occhiali di sicurezza e un camice da laboratorio. Il cloroformio deve essere conservato in armadi ventilati lontano da altri solventi infiammabili.</li>
	<li>Utilizzando la deposizione evaporativa a fascio termico o elettronico, depositare 3 nm di uno strato di adesione al titanio a 1 Å/s seguito da 100−150 nm di alluminio a 4 Å/s intorno e sopra i pali di rame. NOTA: Si può usare rivestimenti più spessi per ottenere guide più profonde e una migliore attenuazione della fluorescenza di fondo, ma questo diminuisce anche la resa dopo aver esposto e dissolto i post nella fase successiva (vedi la sezione discussione).</li>
	<li>Per sciogliere i pali metallici, immergere le copertine in incisione di rame (a base di acido citrico; Tavola dei materiali) per 2 ore. ATTENZIONE: L'incisione metallica può causare ustioni alla pelle. Lavorare con le incisioni sotto una cappa ben ventilata e indossare dispositivi di protezione. Lavarsi accuratamente le mani dopo la manipolazione. L'incisione metallica deve essere conservata in armadi ventilati designati per liquidi corrosivi.</li>
	<li>Risciacquare i copricapo con acqua distillata, asciugare con N2e lucidare delicatamente la superficie del rivestimento metallico con carta lente per esporre eventuali pali che sono ancora coperti di rivestimento. Riposizionare le coverlips in incisione di rame per altre 2 ore, quindi risciacquare di nuovo con acqua distillata e asciugare con N2. NOTA: le diapositive ZMW devono essere conservate in piastre di Petri coperte e pulite per mantenerle libere da contaminanti.</li>
</ol>5. Nanofabbricazione di guide d'onda in modalità zero oro utilizzando il modello di cristallo colloidale
NOTA: Il metodo per fabbricare ZW d'oro (Figura supplementare 1), che rispecchia il protocollo per fabbricare ZW in alluminio, è fornito in questa sezione.
<ol><li>Utilizzando la deposizione evaporativa a fascio termico o elettronico, depositare 3 nm di uno strato di adesione al titanio a 1 Å/s seguito da 300 nm di alluminio a 4 Å/s.</li>
	<li>Rimuovere il metallo in eccesso sopra le perline premendo delicatamente la superficie con del nastro adesivo. Sbucciare lentamente il nastro per estrarre il metallo.</li>
	<li>Per sciogliere le perline di polistirolo, posizionare i modelli di perline in toluene e immergersi durante la notte.</li>
	<li>Dopo l'incubazione del toluene, sciacquare i modelli una volta con cloroformio e due volte con etanolo. Asciugare i modelli con N2 e rimuovere i contaminanti polimerici residui in un detergente al plasma di ossigeno per 30 minuti.</li>
	<li>Utilizzando la deposizione evaporativa del fascio termico o elettronico, depositare 100−150 nm di oro a 5 Å/s intorno e sopra i pali di alluminio.</li>
	<li>Per sciogliere i pali metallici, immergere le coperture in incisione in alluminio (a base di acido fosforico; Tavola dei materiali) per 1 h.</li>
	<li>Risciacquare i copricapo con acqua distillata, asciugare con N2e lucidare delicatamente la superficie del rivestimento metallico con carta lente per esporre eventuali pali che sono ancora coperti di rivestimento. Riposizionare i copricapo in incisione in alluminio per 1 h, quindi risciacquare nuovamente con acqua distillata e asciugare con N2. NOTA: le diapositive ZMW devono essere conservate in piastre di Petri coperte e pulite.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per l'auto-assemblaggio colloidale (sezione del protocollo 2), l'uso di etanolo piuttosto che di acqua come solvente di sospensione accelera il processo di evaporazione in modo che i modelli siano pronti in 2−3 minuti dopo la deposizione piuttosto che 1−2 h come nei metodiprecedenti 48,49. Il protocollo di sedimentazione evaporativa qui presentato è anche più semplice dei precedenti protocolli di sedimentazione che richiedono il controllo dell'inclinazione ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.
Figure 3 was updated from:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.

Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Tecniche a singola molecola come il trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza a singola molecola (smFRET) o la spettroscopia di correlazione a fluorescenza a singola molecola (FCS) sono potenti strumenti per la biofisica molecolare, consentendo lo studio di movimenti dinamici, conformazioni e interazioni di singole biomolecole in processi come la trascrizione1,2,3,traduzione4,5,6e molti altri7. Per smFRET, la microscopia tirf (Total Internal Reflection Fluorescence) è un metodo comune perché molte molecole legate possono essere seguite nel tempo e l'onda evanescente generata dal TIR è limitata a una regione di 100−200 nm adiacente al coverslip8. Tuttavia, anche con questa limitazione del volume di eccitazione, i fluorofori di interesse devono ancora essere diluiti in intervalli di pM o nM al fine di rilevare segnali di singola molecola al di sopra della fluorecenza di fondo9. Poiché le costanti michaelis-menten degli enzimi cellulari sono tipicamente nell'intervallo da μM a mM10, le reazioni biochimiche negli studi su singole molecole sono di solito molto più lente di quelle nella cellula. Ad esempio, la sintesi proteica avviene a 15−20 aminoacidi al secondo in E. coli11,12,mentre la maggior parte dei ribosomi procariotici negli esperimenti smFRET si traducono in 0,1−1 aminoacido al secondo13. Nella sintesi proteica, le strutture cristalline e lo smFRET sui ribosomi in stallo hanno mostrato che gli RRNA di trasferimento (tRNA) oscillano tra stati "ibridi" e "classici" prima della traslocazione tRNA-mRNAfase 14,15. Tuttavia, quando erano presenti concentrazioni fisiologiche del fattore GTPasi di traslocazione, EF-G, è stata osservata una conformazione diversa, intermedia tra gli stati ibridi e classici, in smFRET6. Studiare processi molecolari dinamici a tassi e concentrazioni simili a quelli della cellula è importante, ma rimane una sfida tecnica.
Una strategia per aumentare la concentrazione del substrato fluorescente è l'uso di aperture di lunghezza d'onda sub-visibile a base di metallo, chiamate guide d'onda in modalità zero (ZMW), per generare campi di eccitazione confinati che eccitano selettivamente le biomolecole localizzate all'interno delle aperture16 (Figura 1). Le aperture hanno in genere un diametro di 100−200 nm e una profondità di 100−150 nm17. Al di sopra di una lunghezza d'onda di taglio correlata alla dimensione e alla forma dei pozzi (λc ≈ 2,3 volte il diametro per le guide d'onda circolari con acqua come mezzo dielettrico18), non sono consentiti modi di propagazione nella guida d'onda, da cui il termine guide d'onda in modalità zero. Tuttavia, un campo elettromagnetico oscillante, direttamente un'onda evanescente, in decomposizione esponenziale in intensità tunnela ancora a breve distanza nella guida d'onda18,19. Sebbene simili alle onde evanescenti TIR, le onde evanescenti ZMW hanno una costante di decadimento più breve, con conseguente regione di eccitazione effettiva di 10−30 nm all'interno della guida d'onda. A concentrazioni micromolari di ligandi etichettati fluorescentmente, solo una o poche molecole sono simultaneamente presenti all'interno della regione di eccitazione. Questa limitazione del volume di eccitazione e la conseguente riduzione della fluorescenza di fondo consentono l'imaging a fluorescenza di singole molecole a concentrazioni biologicamente rilevanti. Questo è stato applicato a molti sistemi20,tra cui misurazioni FCS di diffusione di singole proteine21,misurazioni FRET a singola molecola di interazioni ligando-proteina22 a bassa affinità e proteina-proteina23,e misurazioni spettro-elettrochimiche di singoli eventi di turnovermolecolare 24.
Gli ZWW sono stati prodotti modellando direttamente uno strato metallico utilizzando la fresatura difasci ionici 25,26 o litografia a fascio di elettroni (EBL) seguita dall'incisione al plasma16,27. Questi metodi di litografia senza maschera creano guide d'onda in serie e in genere richiedono l'accesso a strutture specializzate di nanofabbricazione, impedendo l'adozione diffusa della tecnologia ZMW. Un altro metodo, il lift-off della litografia nanoimprint ultravioletta28, utilizza uno stampo scorrevole al quarzo per premere un modello ZMW inverso su un film di resistenza come un timbro. Sebbene questo metodo sia più snello, richiede ancora EBL per la fabbricazione dello stampo al quarzo. Questo articolo presenta il protocollo per un metodo di fabbricazione basato su modelli semplice ed economico che non richiede la fresatura EBL o fasci di ioni e si basa sull'imballaggio ravvicinato di nanosfere per formare una maschera litografica.
La nanosfera o litografia "naturale", proposta per la prima volta nel 1982 da Deckman e Dunsmuir29,30, utilizza l'auto-assemblaggio di particelle colloidali monodisperse, che vanno da decine di nanometri a decine di micrometri31,per creare modelli per la creazione di superfici attraverso l'incisione e/o la deposizione di materiali. Gli array periodici estesi bidimensionali (2D) o tridimensionali (3D) di particelle colloidali, denominati cristalli colloidali, sono caratterizzati da una luminosa iridescenza dallo scattering e dalla diffrazione32. Sebbene meno ampiamente utilizzata del fascio di elettroni o della fotolitografia, questa metodologia di mascheramento è semplice, a basso costo e facilmente ridimensionabile per creare dimensioni delle funzionalità inferiori a 100 nm.
Dirigere l'auto-assemblaggio delle particelle colloidali determina il successo dell'uso dei cristalli colloidali come maschere per la creazione di superfici. Se le dimensioni e la forma delle particelle sono omogenee, le particelle colloidali possono essere facilmente auto-assemblate con imballaggio esagonale, guidate dall'esaurimentoentropico 33. L'evaporazione dell'acqua dopo il rivestimento a goccia è un percorso efficace per sedimentare le particelle colloidali, anche se altri metodi includono il dip-coating34,il rivestimento di spin35,la deposizione elettroforetica36e il consolidamento in un'interfaccia aria-acqua37. Il protocollo presentato di seguito si basa sul metodo di sedimentazione dell'evaporazione, che è stato il più semplice da implementare. Gli interstizi triangolari tra perline di polistirene imballate a distanza ravvicinata formano aperture in cui placcare un metallo sacrificale, formando pali(Figura 2 e Figura supplementare 1). Breve ricottura delle perline prima che questo passaggio adatti la forma e il diametro di questi pali. Le perline vengono rimosse, uno strato metallico finale viene depositato intorno ai pali e quindi i pali vengono rimossi. Dopo che i due passaggi di deposizione metallica sulla nanomaschera colloidale, rimozione dei post intermedi e modifica della chimica delle superfici per la passivazione e il tethering, gli array ZMW sono pronti per l'uso per l'imaging a singola molecola. Una caratterizzazione più estesa delle proprietà ottiche ZMW dopo la fabbricazione può essere trovata in un articolo38 di accompagnamento. Oltre a un evaporatore termico per la deposizione di vapore dei metalli, non sono necessari strumenti specializzati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:667px;" width="668">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1. Glass Coverslip Cleaning</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Acetone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coplin glass staining jar</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-817</td>
			<td>Staining jar with 8 grooves and molded glass cover</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:103px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48404-467</td>
			<td>24 mm x 30 mm (No.1&#189;, Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">KOH</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R80115TS</td>
			<td>100 mm diameter, 15 mm deep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sonicator</td>
			<td style="width:103px;">Branson</td>
			<td style="width:119px;">Z245143</td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 5510</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Clear storage container</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-110-8222</td>
			<td>26 x 18 x 15 in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Desk fan</td>
			<td style="width:103px;">O2Cool</td>
			<td style="width:119px;">FD05001A</td>
			<td>Any small desk (~5 in.) fan will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glass beaker</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-555-25B</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Humidity meter</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-661-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21-402-903</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polystyrene microspheres</td>
			<td style="width:103px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">18602-15</td>
			<td>1.00 &#181;m diameter, non-functionalized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X-100 deturgent</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Aluminum plate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AA11062RY</td>
			<td>Customized in-house to 14 cm x 14 cm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Ceramic hotplate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">HP88857100</td>
			<td>13 x 8.2 x 3.8 in.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">38615K71</td>
			<td>Read temperature with thermocouple probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thermocouple probe</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">9251T93</td>
			<td>Type K, surface probe</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">Type A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAL40QXHB</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Chloroform</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">49-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMCU40QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gold pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAUXX40G</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lens paper</td>
			<td style="width:103px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:103px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:119px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:103px;">Staples</td>
			<td style="width:119px;">MMM119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Thin film deposition system</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">PVD-75</td>
			<td>Tabletop thermal evaporation system will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Titanium pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMTI45QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Toluene</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">244511</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Representative Results</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">COMSOL Multiphysics Modeling Software</td>
			<td>COMSOL, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dual View spectral splitter</td>
			<td style="width:103px;">Photometrics, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy

La fluorescenza a singola molecola, la fluorescenza di fondo da substrati etichettati in soluzione spesso limita la concentrazione di fluoroforo a intervalli pico- a nanomolari, diversi ordini di grandezza inferiori a molte concentrazioni fisiologiche di ligando. Le nanostrutture ottiche chiamate guide d'onda a modalità zero (ZWW), che hanno aperture di diametro di 100−200 nm fabbricate in un sottile metallo conduttore come l'alluminio o l'oro, consentono l'imaging di singole molecole a concentrazioni micromolari di fluorofori limitando l'eccitazione della luce visibile ai volumi efficaci dello zeptoliter. Tuttavia, la necessità di apparecchiature di nanofabbricazione costose e specializzate ha precluso l'uso diffuso di ZWW. Tipicamente, nanostrutture come gli ZMW sono ottenute scrivendo direttamente usando la litografia a fascio di elettroni, che è sequenziale e lenta. Qui, colloidale, o nanosfera, la litografia è usata come strategia alternativa per creare maschere su scala nanometrica per la fabbricazione di guide d'onda. La presente relazione descrive l'approccio in dettaglio, con considerazioni pratiche per ogni fase. Il metodo consente di creare migliaia di ZW in alluminio o oro in parallelo, con diametri e profondità finali della guida d'onda di 100−200 nm. Sono necessarie solo attrezzature da laboratorio comuni e un evaporatore termico per la deposizione di metalli. Rendendo gli ZMW più accessibili alla comunità biochimica, questo metodo può facilitare lo studio dei processi molecolari a concentrazioni e velocità cellulari.

L'auto-assemblaggio delle particelle colloidali di polistirolo attraverso la sedimentazione evaporativa (fasi 2.1−2.13) può produrre una serie di risultati poiché richiede il controllo del tasso di evaporazione del solvente. Tuttavia, poiché le deposizioni sono veloci (10−15 minuti per round), la procedura può essere rapidamente ottimizzata per diverse condizioni di laboratorio ambientale. La figura 3A mostra un modello colloidale ben formato dopo la deposizione e l'evaporazione. Mac...

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Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Qui è descritto un metodo di litografia a nanosfera per la fabbricazione parallela di guide d'onda in modalità zero, che sono array di nanoperture in una microscopia in vetro rivestita di metallo coverlip per l'imaging di singole molecole a concentrazioni nano-micromolari di fluorofori. Il metodo sfrutta l'autoassemicolo del cristallo colloidale per creare un modello di guida d'onda.

Fabbricazione di guide d'onda in modalità zero per microscopia ad alta concentrazione a singola molecola

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

fabrication-zero-mode-waveguides-for-high-concentration-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.8K Views.  University of Pennsylvania. Qui è descritto un metodo di litografia a nanosfera per la fabbricazione parallela di guide d'onda in modalità zero, che sono array di nanoperture in una microscopia in vetro rivestita di metallo coverlip per l'imaging di singole molecole a concentrazioni nano-micromolari di fluorofori. Il metodo sfrutta l'autoassemicolo del cristallo colloidale per creare un modello di guida d'onda.

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Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

Low-Cost Cryo-Stage Light fabbricazione microscopia per Luce correlate / Microscopia Elettronica

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Ricerca

Bioingegneria

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplex singola molecola Forza Misure proteolisi con delle pinzette magnetiche

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Fabrication of Carbon Nanotube High-Frequency Nanoelectronic Biosensor for Sensing in High Ionic Strength Solutions

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them good candidates for high sensitivity biosensors. When a charged molecule binds to such a sensor surface, it alters the carrier density5 in the sensor, resulting in changes in its DC conductance. However, in an ionic solution a charged surface also attracts counter-ions from the solution, forming an electrical double layer (EDL). This EDL effectively screens off the charge, and in physiologically relevant conditions ~100 millimolar (mM), the characteristic charge screening length (Debye length) is less than a nanometer (nm). Thus, in high ionic strength solutions, charge based (DC) detection is fundamentally impeded6-8.
We overcome charge screening effects by detecting molecular dipoles rather than charges at high frequency, by operating carbon nanotube field effect transistors as high frequency mixers9-11. At high frequencies, the AC drive force can no longer overcome the solution drag and the ions in solution do not have sufficient time to form the EDL. Further, frequency mixing technique allows us to operate at frequencies high enough to overcome ionic screening, and yet detect the sensing signals at lower frequencies11-12. Also, the high transconductance of SWNT transistors provides an internal gain for the sensing signal, which obviates the need for external signal amplifier.
Here, we describe the protocol to (a) fabricate SWNT transistors, (b) functionalize biomolecules to the nanotube13, (c) design and stamp a poly-dimethylsiloxane (PDMS) micro-fluidic chamber14 onto the device, and (d) carry out high frequency sensing in different ionic strength solutions11.

We describe the device fabrication and measurement protocol for carbon nanotube based high frequency biosensors. The high frequency sensing technique mitigates the fundamental ionic (Debye) screening effect and allows nanotube biosensor to be operated in high ionic strength solutions where conventional electronic biosensors fail. Our technology provides a unique platform for point-of-care (POC) electronic biosensors operating in physiologically relevant conditions.

Fabbricazione di Nanotubi di carbonio ad alta frequenza Nanoelectronic biosensore per la rilevazione in alta forza ionica Solutions

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Indagare Sistemi recettore-ligando del Cellulosome con sede a AFM singola molecola di Forza Spettroscopia

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using sonication, mechanical agitation, microfluidic devices, or homogenization. Recently, lipid-based oxygen microbubbles (LOMs) have been designed to deliver oxygen intravenously during medical emergencies, reversing life-threatening hypoxemia, and preventing subsequent organ injury, cardiac arrest, and death. We present methods for scaled-up production of highly oxygenated microbubbles using a closed-loop high-shear homogenizer. The process can produce 2 L of concentrated LOMs (90% by volume) in 90 min. Resulting bubbles have a mean diameter of ~2 &#956;m, and a rheologic profile consistent with that of blood when diluted to 60 volume %. This technique produces LOMs in high capacity and with high oxygen purity, suggesting that this technique may be useful for translational research labs.

We describe methods for the manufacture of large volumes of lipid-based oxygen microbubbles (LOMs) designed for intravenous oxygen delivery using high-shear homogenization and serial concentration.

Fabbricazione di concentrato, ossigeno a base di lipidi microbolle emulsioni da High Shear omogeneizzazione e concentrazione seriale

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Singola molecola microscopia a fluorescenza su Planar bilayers supportati

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Singola molecola di rilevamento senza etichetta di testo usando Microtoroid ottici Risonatori

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic resonance (MR) microscopy data. While it is possible to perform MR collections on living, excised mammalian tissue, such experiments have traditionally been constrained by resolution limits and are thus incapable of visualizing tissue microstructure. Conversely, MR protocols that did achieve microscopic image resolution required the use of fixed samples to accommodate the need for static, unchanging conditions over lengthy scan times. The current protocol describes the first available MR technique that enables imaging of living, mammalian tissue samples at microscopic resolutions. Such data is of great importance to the understanding of how pathology-based contrast changes occurring at the microscopic level influence the content of macroscopic MR scans such as those used in the clinic. Once such an understanding is realized, diagnostic methods with greater sensitivity and accuracy can be developed, which will translate directly to earlier disease treatment, more accurate therapy monitoring and improved patient outcomes.
While the described methodology focuses on brain slice preparations, the protocol is adaptable to any excised tissue slice given that changes are made to the gas and perfusate preparations to accommodate the tissue&#39;s specific metabolic needs. Successful execution of the protocol should result in living, acute slice preparations that exhibit MR diffusion signal stability for periods up to 15.5 h. The primary advantages of the current system over other MR compatible perfusion apparatuses are its compatibility with the MR microscopy hardware required to attain higher resolution images and ability to provide constant, uninterrupted flow with carefully regulated perfusate conditions. Reduced sample throughput is a consideration with this design as only one tissue slice may be imaged at a time.

The current protocol describes a method by which users can maintain viability of acute hippocampal and cortical slice preparations during the collection of magnetic resonance microscopy data.

Supporto metabolico di asportato, tessuti di cervello viventi durante l'acquisizione di microscopia a risonanza magnetica

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...