Bu çalışma NIH hibeleri R01GM080376, R35GM118139 ve NSF Mühendislik Merkezi MechanoBiology CMMI: 15-48571'den Y.E.G.'ye ve NIAID doktora öncesi NRSA bursu F30AI114187'den R.M.J.'ye desteklendi.

NOT: Tüm adımlar genel laboratuvar alanında tamamlanabilir.
1. Cam kapak temizliği
<ol><li>Kolloidal parçacıkların buharlaştırıcı birikmesi için temiz bir yüzey sağlamak için, temizlik için coplin cam boyama kavanozunun yivli kesici uçlarına 24 x 30 mm optik borosilikat cam kapak örtüleri (0,16−0,19 mm kalınlık) yerleştirin. NOT: Temizlik işlemi sırasında tüm yüzeylerin net bir şekilde açığa çıkması için kapakların dik durduğundan ve iyi ayrıldığından emin olun.</li>
	<li>Boyama kavanozuna örtüleri örtecek, kapağı yerize edecek ve 40 ° C'de 10 dakika boyunca sonicate edecek kadar aseton dökün.</li>
	<li>Asetonu dökün ve boyama kavanozuna damıtılmış H2O doldurup suyu dökerek kapakları durulayın. 2 kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Aseton sonication (adım 1.2 ve 1.3) bir kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>40 ° C'de 20 dakika boyunca örtüleri ve sonikatı kaplayacak kadar kavanoza 200 mM KOH dökün. NOT: KOH camı hafifçe etches.</li>
	<li>Kapakları damıtılmış H 2 Oile 6kez durulayın.</li>
	<li>Kapakları örtmek için etanol ekleyin, kapağı ekleyin ve 40 ° C'de 10 dakika boyunca sonicate.</li>
	<li>Kapakları damıtılmış H ile2O 3 kez durulayın.</li>
	<li>Yumuşak tokparlaplar kullanarak her kapak kapağını kenardan alın ve kapakları N2 gazı ile kurutun. Sadece kapak ucunun kenarlarına dokunun. Kurutulmuş, temizlenmiş kapak örtülerinin her birini ayrı bir temiz Petri kabına yerleştirin.</li>
</ol>2. Polistiren boncukların buharlaştırıcı birikmesi
<ol><li>ZMW dizisi için kolloidal kristal maske oluşturmak için, 1 μm çapında 50 μL santrifüj, 15.000 x g,25 °C'de 5 dakika boyunca işlevsel olmayan polistiren boncuklar (suda% 2,5 w/ v). NOT: Boncukları pipetlemeden önce, boncukların şişenin dibine yerleşmesi durumunda stok çözeltisi kısa bir süre girdaplanmalıdır.</li>
	<li>Mümkün olduğunca az su bırakarak süpernatant atın. NOT: Artık su etanol resüspenzyon39buharlaşma özelliklerini değiştirebilir, bu nedenle tüm suyu çıkarmak için az miktarda boncuk çıkarılması kabul edilebilir.</li>
	<li>Boncukları adım 2.2'den 1:400 TritonX-100:etanol çözücünün 50 μL'sinde yeniden atın. Pipet, boncukları çözücü ile iyice karıştırmak için birkaç kez yukarı ve aşağı. NOT: TritonX-100:etanol çözücü kullanımdan sonra parafin filmi ile kapatılmalı ve ayda bir kez taze olarak hazırlanmalıdır. Boncuklar, mikrosantrifüj tüpü gibi plastik bir kabın kenarlarına yapışma eğilimindedir, bu nedenle tüm boncukların yeniden dirilmesini sağlamak için yanlar boyunca pipet.</li>
	<li>Biriktirme için bir nem odası kurmak için, her biri bir kapaklı 6 Petri kabını, kapakları biraz aralık bırakılmış bir çizgide bir bankın üzerine yerleştirin. Her yemekte, bir sonraki adımda nem arttığında kapak örtülerinin ortama maruz kalabilmesi için kapakçığı açık bölgeye taşıyın.</li>
	<li>Petri tabaklarının arkasına bir higrometre ve küçük bir elektrikli fan yerleştirin.</li>
	<li>Laboratuvarda başlangıç bağıl nemini (RH) kaydedin. 200 mL'lik bir kabı 150−200 mL ~75 °C su ile doldurun ve fanın arkasına yerleştirin.</li>
	<li>Fanı açın ve Petri kaplarını, fanı, kabı ve higrometreyi devrilmiş, şeffaf bir plastik saklama kabıyla (66 cm x 46 cm x 38 cm) örtün.</li>
	<li>Haznedeki RH'nin %70−75'e yükselmesine izin verin, bu da tipik olarak 5−10 dakika sürer. NOT: Ortam laboratuvarı RH'si düşükse (~%50'nin altında), biriktirme sırasındaki nem kaybını telafi etmek için odanın daha yüksek bir RH'ye ulaşmasını, ancak% 80'den yüksek olmamasını sağlar (aşağıya bakın).</li>
	<li>RH% 70−75'e ulaştığında, RH'yi kaydedin ve plastik saklama kabını hafifçe kaldırarak petri kaplarına kapakları hızlı bir şekilde yerleştirin, bu da kapakların aşırı ıslanmasını önler. NOT: Haznedeki sıcaklık, nemlendirme sonucu oda sıcaklığından biraz daha sıcak olacaktır, tipik olarak 25−26 °C. Kapaklarda nem görünüyorsa, cam yüzeyler çok ıslaktır. Ticari bir torpido gözü protokolün bu bölümünü basitleştirebilir.</li>
	<li>Odadaki RH%85'e yükselmeye devam etsin. Bu noktada, RH'yi nem haznesine kaydedin ve boncuk süspansiyonunun pipeti 5 μL'yi her kapak kapağının ortasına kaydedin.</li>
	<li>Nem kaybını en aza indirmek için her biriktirmeden sonra odayı ve Petri tabaklarını kapatın. 2 dakika içinde tüm 6 ifadeleri bitirmek hedefleyin.</li>
	<li>İfadeden sonra RH'yı hazneye kaydedin. NOT: Biriktirmeden sonraki RH, ortam laboratuvarı koşullarına bağlı olarak biriktirme sırasında nemin ne kadar hızlı kaybolduğunu ölçmeye yardımcı olacaktır. Tipik bir başarılı çalışma için, oda ifadeden önce% 85 RH'den başlayacak ve ifadeden sonra% 70−75 RH'de sona erecektir.</li>
	<li>Boncuk damlacıklarının yayılmasına ve 5 dakika kurumasına izin verin. NOT: Kolloidal kristallerin çok sayıda deliği veya çok katmanlı bölgesi varsa, oda sırasıyla çok nemli veya kuruydu. Petri kaplarını kapatmak ve ifadelere başlamak için bağıl nemi ayarlayın (optimizasyonun daha fazla tartışılması için sonuçlar bölümüne bakın).</li>
</ol>3. Kolloidal kristal şablonunda gözenek boyutunu azaltmak için boncuk tavlama
<ol><li>Boncuklar arası kesişme yerlerini daraltan ve interstices'in köşelerini yuvarlayan polistiren boncukların tavlama için düzgün bir sıcaklık yüzeyi sağlamak için, standart bir seramik sıcak plakanın üzerine düz, öğütülmüş bir alüminyum plaka yerleştirin.</li>
	<li>Sıcak plakanın sıcaklığını 107 °C'ye, polistirenin cam geçiş sıcaklığını40'aayarlayın. NOT: Kararlı ve doğru sıcaklık elde etmek için alüminyum plakada 2−3 mm genişliğinde ve 4−5 mm derinliğinde bir delikte bir termokuple probu tutulmuş.</li>
	<li>Sıcak alüminyum plakaya boncuk şablonunun ve 20 sn tavlamanın üzerine boncuk şablonunun bulunduğu bir kapak ucu yerleştirin (erime süresinin açıklanması için tartışma bölümüne bakın).</li>
	<li>Isıttıktan sonra, kapak kapağını alüminyum plakadan çıkarın ve soğutmak için derhal başka bir oda sıcaklığındaki alüminyum yüzeye yerleştirin. NOT: Kapakların teslim alımını kolaylaştırmak için kapak kapaklarının plakanın kenarına hafifçe asması veya sığ kanalları (beraberindeki videoya bakın) plakaya asması yararlıdır.</li>
</ol>4. Kolloidal kristal şablonu kullanılarak alüminyum sıfır mod dalga kılavuzlarının nanofabrikasyonu
<ol><li>Termal veya elektron ışını buharlaştırıcı biriktirme kullanarak, boncuklar arasındaki kafeslerde direkler oluşturmak için kolloidal kristal şablonun üzerine 2 Å/sn'de 300 nm bakır biriktirin.</li>
	<li>Yüzeye bantla hafifçe bastırarak boncukların üstündeki fazla metali çıkarın. Metali çıkarmak için bandı yavaşça soyun. NOT: Bant çekildikten sonra bazı küçük yansıtıcı fazla metal lekeleri kalabilir ve bunlar genellikle N2 gazı akışı ile çıkarılabilir. Bant çekildikten sonra önemli yansıtıcı fazla metal lekeleri kalırsa, polistiren boncukları kısmen çözmek için şablonları 2 saat boyunca toluen içine çekmeyi deneyin. Kapakları damıtılmış suyla yıkayın, N2ile kurulayın ve bant çekmesini tekrarlayın. Boncuklar bant çekme sırasında direkleri hasardan korumaya yardımcı olduğu için ek ıslatma boncukları tamamen çözmemelidir.</li>
	<li>Polistiren boncukları çözmek için boncuk şablonlarını toluene yerleştirin ve gece boyunca ıslatın. DİkKAT: Toluen dumanı toksik olabilir. İyi havalandırılmış bir kaputun altında toluen ile çalışın ve eldivenler, güvenlik gözlükleri ve laboratuvar önlüğü de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipmanlar giyin. Toluen yanıcı sıvılar için belirlenmiş havalandırmalı dolaplarda saklanmalıdır.</li>
	<li>Toluen inkübasyonundan sonra, şablonları bir kez kloroform ve iki kez etanol ile durulayın. Hassas 200−300 nm boyundaki metal direkler artık açığa çıktığı için bu noktada kapak örtülerini dikkatlice tutturun. Şablonları N2 ile kurutun ve oksijen plazma temizleyicisinde kalan polimer ve kirleticileri 30 dakika boyunca çıkarın. DİkKAT: Kloroform dumanlar toksik olabilir. İyi havalandırılmış bir kaputun altında kloroformla çalışın ve eldivenler, güvenlik gözlükleri ve laboratuvar önlüğü de dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipmanlar giyin. Kloroform, diğer yanıcı çözücülerden uzakta havalandırılmış dolaplarda saklanmalıdır.</li>
	<li>Termal veya elektron ışını buharlaştırıcı biriktirme kullanarak, 1 Å/s'de 3 nm titanyum yapışıklık tabakası ve ardından bakır direklerin etrafında ve üstünde 4 Å/s'de 100−150 nm alüminyum biriktirin. NOT: Daha derin kılavuzlar ve arka plan floresanının daha iyi zayıflamasını elde etmek için daha kalın kaplamalar kullanılabilir, ancak bu aynı zamanda bir sonraki adımda gönderileri açığa çıkardıktan ve çözdükten sonra verimi azaltır (tartışma bölümüne bakın).</li>
	<li>Metal direkleri çözmek için, kapakları bakır etchant (sitrik asit bazlı) içine batırın; Malzeme Masası) 2 saat boyunca. DİkKAT: Metal etchant cilt yanıklara neden olabilir. İyi havalandırılmış bir kaputun altında etchantlarla çalışın ve koruyucu ekipman giyin. Elleçlemeden sonra ellerinizi iyice yıkayın. Metal etchant, aşındırıcı sıvılar için belirlenmiş havalandırmalı dolaplarda saklanmalıdır.</li>
	<li>Kapakları damıtılmış suyla durulayın, N2ile kurutun ve hala kaplama ile kaplı herhangi bir gönderiyi ortaya çıkarmak için metal kaplamanın yüzeyini lens kağıdı ile hafifçe buff. Kapakları 2 saat daha bakır vbhant içine yerleştirin, sonra damıtılmış su ile tekrar durulayın ve N2ile kurulayın. NOT: ZMW slaytlar, kirleticilerden uzak tutmak için kapalı, temiz Petri kaplarında saklanmalıdır.</li>
</ol>5. Kolloidal kristal şablonu kullanılarak altın sıfır mod dalga kılavuzlarının nanofabrikasyonu
NOT: Alüminyum ZMWs imal protokolü yansıtan altın ZMWs(Ek Şekil 1)imal yöntemi bu bölümde verilmiştir.
<ol><li>Termal veya elektron ışını buharlaştırıcı biriktirme kullanarak, 1 Å/s'de 3 nm titanyum yapışıklık tabakası ve ardından 4 Å/s'de 300 nm alüminyum biriktirin.</li>
	<li>Yüzeye bantla hafifçe bastırarak boncukların üstündeki fazla metali çıkarın. Metali çıkarmak için bandı yavaşça soyun.</li>
	<li>Polistiren boncukları çözmek için boncuk şablonlarını toluene yerleştirin ve gece boyunca ıslatın.</li>
	<li>Toluen inkübasyonundan sonra, şablonları bir kez kloroform ve iki kez etanol ile durulayın. Şablonları N2 ile kurutun ve oksijen plazma temizleyicisinde kalan polimer kirleticileri 30 dakika boyunca çıkarın.</li>
	<li>Termal veya elektron ışını buharlaştırıcı biriktirmeyi kullanarak, alüminyum direklerin etrafında ve üstünde 5 Å/s'de 100−150 nm altın biriktirin.</li>
	<li>Metal direkleri çözmek için, kapakları alüminyum etchant (fosforik asit bazlı) içine batırın; Malzeme Masası) 1 saat boyunca.</li>
	<li>Kapakları damıtılmış suyla durulayın, N2ile kurutun ve hala kaplama ile kaplı herhangi bir gönderiyi ortaya çıkarmak için metal kaplamanın yüzeyini lens kağıdı ile hafifçe buff. Kapakları 1 saat boyunca alüminyum vbhant içine geri yerleştirin, ardından damıtılmış su ile tekrar durulayın ve N2ile kurulayın. NOT: ZMW slaytlar kapalı, temiz Petri kaplarında saklanmalıdır.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Kolloidal kendi kendine montaj için (protokol bölüm 2), süspansiyon çözücü olarak su yerine etanol kullanımı buharlaşma işlemini hızlandırır, böylece şablonlar önceki yöntemlerde olduğu gibi 1−2 saat yerine 2−3 dakika içinde hazırlanır48,49. Burada sunulan evaporatif sedimentasyon protokolü, süspansiyon49,50,51'inüzerindeki yüzey eğimini, sıcaklığı ve hava ha...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.
Figure 3 was updated from:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.

Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET) veya tek moleküllü floresan korelasyon spektroskopisi (FCS) gibi tek moleküllü teknikler moleküler biyofizik için güçlü araçlardır, transkripsiyon1, 2 ,3, çeviri4,5,6ve diğerleri gibi süreçlerde bireysel biyomoleküllerin dinamik hareketlerinin, konformasyonlarının ve etkileşimlerinin incelenmesine izin verir7. SmFRET için, total iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopisi yaygın bir yöntemdir, çünkü birçok bağlı molekül zamanla takip edilebilir ve TIR tarafından oluşturulan evanescent dalgası kapak8'ebitişik 100−200 nm bölgesi ile sınırlıdır. Bununla birlikte, ekscitasyon hacmindeki bu kısıtlamaya rağmen, arka plan floresanının üzerindeki tek molekül sinyallerini tespit etmek için ilgi flüforlarının pM veya nM aralıklarına seyreltilmesi gerekir9. Hücresel enzimlerin Michaelis-Menten sabitleri tipik olarak μM ila mM aralığında10olduğundan, tek molekül çalışmalarında biyokimyasal reaksiyonlar genellikle hücredekilerden çok daha yavaştır. Örneğin, protein sentezi E. coli11 , 12'de saniyede15−20amino asittegerçekleşirken,smFRET deneylerindeki prokaryotik ribozomların çoğu saniyede 0.1−1 amino asitte tercümeedilir 13. Protein sentezinde, duran ribozomlardaki kristal yapılar ve smFRET, transfer RNA'larının (tRNA'lar) tRNA-mRNA translokasyon adımı14,15'denönce 'hibrit' ve 'klasik' durumlar arasında dalgalanarak dalgalandırdığını göstermiştir. Bununla birlikte, translokasyon GTPase faktörüNÜN fizyolojik konsantrasyonları ef-G mevcut olduğunda, smFRET6'damelez ve klasik durumlar arasında orta olan farklı bir konformasyon gözlenmiştir. Dinamik moleküler süreçleri hücredekilere benzer oranlarda ve konsantrasyonlarda incelemek önemlidir, ancak teknik bir zorluk olmaya devam etmektedir.
Floresan substrat konsantrasyonunu artırmaya yönelik bir strateji,16 diyafram açıklıkları içinde lokalize biyomolekülleri seçici olarak heyecanlandıran sınırlı uyarlama alanları oluşturmak için sıfır mod dalga kılavuzları (ZMWs) adı verilen metal bazlı, alt görünür dalga boyu diyaframlarının kullanılmasıdır (Şekil 1). Diyafram açıklıkları tipik olarak 100−200 nm çapında ve 100−150 nm derinlik17' dir. Kuyuların büyüklüğü ve şekli ile ilgili bir kesme dalga boyunun üzerinde (φc ≈ dielektrik orta 18 olarak su ile dairesel dalga kılavuzları için çapın2,3katı), dalga kılavuzunda yayılma modlarına izin verilmez, bu nedenle sıfır mod dalga kılavuzları terimi. Bununla birlikte, salınımlı bir elektromanyetik alan, evanescent dalgası olarak adlandırılan, yoğunlukta katlanarak çürüyen hala dalga kılavuzuna kısa bir mesafe tüneller18,19. TIR evanescent dalgalarına benzer olmasına rağmen, ZMW evanescent dalgaları daha kısa bir çürüme sabitine sahiptir ve bu da dalga kılavuzu içinde 10−30 nm etkili bir eksitasyon bölgesine neden olur. Floresan etiketli ligandların mikromolar konsantrasyonlarında, ekscitasyon bölgesinde aynı anda sadece bir veya birkaç molekül bulunur. Uyarım hacminin bu şekilde kısıtlanması ve bunun sonucunda arka plan floresanının azaltılması, tek moleküllerin biyolojik olarak ilgili konsantrasyonlarda floresan görüntülenmesini sağlar. Bu, tek protein difüzyon21'inFCS ölçümleri, düşük benzeşimli ligand-protein22'nintek moleküllü FRET ölçümleri ve protein-protein etkileşimleri23 ve tek moleküler devir olaylarının spektro-elektrokimyasal ölçümleri dahil olmak üzere birçoksisteme uygulanmıştır 24.
ZMW'ler, iyon ışın frezeleme25, 26veya elektron ışını litografisi (EBL) ve ardından plazma gravür16,27kullanılarak metal bir tabakanın doğrudan desenlenerek üretilmiştir. Bu maskesiz litografi yöntemleri seri olarak dalga kılavuzları oluşturur ve tipik olarak ZMW teknolojisinin yaygın olarak benimsenmesini önleyen özel nanofabrikasyon tesislerine erişim gerektirir. Başka bir yöntem, ultraviyole nanoimprint litografi lift-off28, ters bir ZMW şablonunu damga gibi bir direnç filmine bastırmak için kuvars slayt kalıbı kullanır. Bu yöntem daha aerodinamik olsa da, kuvars kalıbının imalatı için hala EBL gerektirir. Bu makalede, EBL veya iyon ışın frezeleme gerektirmeyen ve litografik bir maske oluşturmak için nanosferlerin yakın paketlenmesine dayanan basit ve ucuz şablonlu bir imalat yöntemi için protokol sunulmaktadır.
İlk olarak 1982 yılında Deckman ve Dunsmuir29,30tarafından önerilen nanosfer veya "doğal" litografi, malzemelerin gravür ve / veya biriktirme yoluyla yüzey deseni için şablonlar oluşturmak için onlarca nanometreden onlarca mikrometre31'ekadar değişen monodisperz kolloidal parçacıkların kendi kendine montajını kullanır. Kolloidal kristaller olarak adlandırılan kolloidal parçacıkların iki boyutlu (2D) veya üç boyutlu (3D) genişletilmiş periyodik dizileri, saçılma ve kırınım32'denparlak bir yanardönerlik ile karakterize edilir. Elektron ışını veya fotolitografiden daha az yaygın olarak kullanılmasına rağmen, bu maskeleme metodolojisi basit, düşük maliyetlidir ve 100 nm'nin altında özellik boyutları oluşturmak için kolayca ölçeklendirilir.
Kolloidal parçacıkların kendi kendine birliğini yönlendirmek, kolloidal kristallerin yüzey desenleme için maske olarak kullanılmasının başarısını belirler. Parçacıkların boyutu ve şekli homojen ise, kolloidal parçacıklar entropik tükenme33tarafından tahrik edilen altıgen ambalaj ile kolayca kendi kendine monte edilebilir. Damla kaplamadan sonra su buharlaşması kolloidal parçacıkları tortulamak için etkili bir yoldur, ancak diğer yöntemler daldırmakaplama 34, spin kaplama35, elektroforetik biriktirme36ve hava-su arayüzünde konsolidasyon37içerir. Aşağıda sunulan protokol, uygulanması en basit olan buharlaşma sedimasyon yöntemine dayanmaktadır. Üçgen, yakın paketlenmiş polistiren boncuklar arasındaki kesişmeler, kurbanlık bir metalin kaplanacağı açıklıklar oluşturur, direkler oluşturur (Şekil 2 ve Ek Şekil 1). Bu adımdan önce boncukların kısa tavlanması, bu direklerin şeklini ve çapını ayarlar. Boncuklar çıkarılır, direklerin etrafına son bir metal tabaka biriktirilir ve ardından direkler kaldırılır. kolloidal nanoküme, ara direklerin çıkarılması ve pasivasyon ve bağlama için yüzey kimyası modifikasyonu üzerine iki metal biriktirme adımından sonra, ZMW dizileri tek molekül görüntüleme için kullanıma hazırdır. İmalat sonrası ZMW optik özelliklerinin daha kapsamlı karakterizasyonu, eşlik eden bir makalede bulunabilir38. Metallerin buhar biriktirmesi için bir termal evaporatör dışında, özel bir alet gerekmez.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:667px;" width="668">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1. Glass Coverslip Cleaning</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Acetone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coplin glass staining jar</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-817</td>
			<td>Staining jar with 8 grooves and molded glass cover</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:103px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48404-467</td>
			<td>24 mm x 30 mm (No.1&#189;, Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">KOH</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R80115TS</td>
			<td>100 mm diameter, 15 mm deep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sonicator</td>
			<td style="width:103px;">Branson</td>
			<td style="width:119px;">Z245143</td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 5510</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Clear storage container</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-110-8222</td>
			<td>26 x 18 x 15 in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Desk fan</td>
			<td style="width:103px;">O2Cool</td>
			<td style="width:119px;">FD05001A</td>
			<td>Any small desk (~5 in.) fan will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glass beaker</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-555-25B</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Humidity meter</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-661-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21-402-903</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polystyrene microspheres</td>
			<td style="width:103px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">18602-15</td>
			<td>1.00 &#181;m diameter, non-functionalized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X-100 deturgent</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Aluminum plate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AA11062RY</td>
			<td>Customized in-house to 14 cm x 14 cm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Ceramic hotplate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">HP88857100</td>
			<td>13 x 8.2 x 3.8 in.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">38615K71</td>
			<td>Read temperature with thermocouple probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thermocouple probe</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">9251T93</td>
			<td>Type K, surface probe</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">Type A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAL40QXHB</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Chloroform</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">49-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMCU40QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gold pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAUXX40G</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lens paper</td>
			<td style="width:103px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:103px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:119px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:103px;">Staples</td>
			<td style="width:119px;">MMM119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Thin film deposition system</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">PVD-75</td>
			<td>Tabletop thermal evaporation system will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Titanium pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMTI45QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Toluene</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">244511</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Representative Results</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">COMSOL Multiphysics Modeling Software</td>
			<td>COMSOL, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dual View spectral splitter</td>
			<td style="width:103px;">Photometrics, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy

Tek moleküllü floresan enzimolojisinde, çözeltideki etiketli substratlardan gelen arka plan floresanları genellikle florofor konsantrasyonu ile piko- nanomolar aralıkları, birçok fizyolojik ligand konsantrasyonundan daha az büyüklük sırasını sınırlar. Alüminyum veya altın gibi ince iletken bir metalde üretilen 100−200 nm çapında diyafram açıklıkları olan sıfır mod dalga kılavuzları (ZMWs) adı verilen optik nanoyapılar, görünür ışık eksiltmeyi zeptoliter etkili hacimlere hapsederek floroforların mikromoler konsantrasyonlarında tek tek moleküllerin görüntülenmesini sağlar. Bununla birlikte, pahalı ve özel nanofabrikasyon ekipmanına duyulan ihtiyaç, ZMW'lerin yaygın kullanımının önüne geçmektedir. Tipik olarak, ZMWs gibi nanoyapılar, sıralı ve yavaş olan elektron ışını litografisi kullanılarak doğrudan yazılarak elde edilir. Burada kolloidal veya nanosfer litografi, dalga kılavuzu imalatı için nanometre ölçeğinde maskeler oluşturmak için alternatif bir strateji olarak kullanılır. Bu rapor, yaklaşımı her aşama için pratik hususlarla ayrıntılı olarak açıklar. Yöntem, son dalga kılavuzu çapları ve derinlikleri 100−200 nm olan binlerce alüminyum veya altın ZMW'ın paralel olarak yapılmasına izin verir. Metal biriktirme için sadece ortak laboratuvar ekipmanı ve termal evaporatör gereklidir. Bu yöntem, ZMW'leri biyokimyasal topluluk için daha erişilebilir hale getirerek, moleküler süreçlerin hücresel konsantrasyonlarda ve oranlarda incelenmesini kolaylaştırabilir.

Polistiren kolloidal parçacıkların buharlaştırıcı sedimansasyon yoluyla kendi kendine montajı (adım 2.1−2.13), çözücü buharlaşma hızının kontrol edilmesi gerektirdiğinden bir dizi sonuç üretebilir. Bununla birlikte, ifadeler hızlı olduğundan (tur başına 10−15 dk), prosedür farklı ortam laboratuvarı koşulları için hızlı bir şekilde optimize edilebilir. Şekil 3A, biriktirme ve buharlaşmadan sonra iyi biçimlendirilmiş bir kolloidal şablon gösterir. Ma...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy at JoVE.com

Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Burada açıklanan, nano-mikromolar florofor konsantrasyonlarında tek molekül görüntüleme için metal kaplı cam mikroskopi kapak kapağındaki nanoapertures dizileri olan sıfır mod dalga kılavuzlarının paralel üretimi için bir nanosfer litografi yöntemidir. Yöntem, bir dalga kılavuzu şablonu oluşturmak için kolloidal kristal kendi kendine montajdan yararlanır.

Yüksek Konsantrasyonlı Tek Moleküllü Mikroskopi için Sıfır Mod Dalga Kılavuzlarının İmalatı

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

fabrication-zero-mode-waveguides-for-high-concentration-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.8K Görüntüleme.  University of Pennsylvania. Burada açıklanan, nano-mikromolar florofor konsantrasyonlarında tek molekül görüntüleme için metal kaplı cam mikroskopi kapak kapağındaki nanoapertures dizileri olan sıfır mod dalga kılavuzlarının paralel üretimi için bir nanosfer litografi yöntemidir. Yöntem, bir dalga kılavuzu şablonu oluşturmak için kolloidal kristal kendi kendine montajdan yararlanır.

Video: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

Düşük Maliyetli Cryo-Işık Mikroskopi Sahne İmalatı İlişkili Işık / Elektron Mikroskopi

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Biyomühendislik

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Fabrication of Carbon Nanotube High-Frequency Nanoelectronic Biosensor for Sensing in High Ionic Strength Solutions

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them good candidates for high sensitivity biosensors. When a charged molecule binds to such a sensor surface, it alters the carrier density5 in the sensor, resulting in changes in its DC conductance. However, in an ionic solution a charged surface also attracts counter-ions from the solution, forming an electrical double layer (EDL). This EDL effectively screens off the charge, and in physiologically relevant conditions ~100 millimolar (mM), the characteristic charge screening length (Debye length) is less than a nanometer (nm). Thus, in high ionic strength solutions, charge based (DC) detection is fundamentally impeded6-8.
We overcome charge screening effects by detecting molecular dipoles rather than charges at high frequency, by operating carbon nanotube field effect transistors as high frequency mixers9-11. At high frequencies, the AC drive force can no longer overcome the solution drag and the ions in solution do not have sufficient time to form the EDL. Further, frequency mixing technique allows us to operate at frequencies high enough to overcome ionic screening, and yet detect the sensing signals at lower frequencies11-12. Also, the high transconductance of SWNT transistors provides an internal gain for the sensing signal, which obviates the need for external signal amplifier.
Here, we describe the protocol to (a) fabricate SWNT transistors, (b) functionalize biomolecules to the nanotube13, (c) design and stamp a poly-dimethylsiloxane (PDMS) micro-fluidic chamber14 onto the device, and (d) carry out high frequency sensing in different ionic strength solutions11.

We describe the device fabrication and measurement protocol for carbon nanotube based high frequency biosensors. The high frequency sensing technique mitigates the fundamental ionic (Debye) screening effect and allows nanotube biosensor to be operated in high ionic strength solutions where conventional electronic biosensors fail. Our technology provides a unique platform for point-of-care (POC) electronic biosensors operating in physiologically relevant conditions.

Yüksek İyonik Güç Çözümleri Algılama için karbon Nanotube Yüksek Frekans nanoelektronik Biyosensör Fabrikasyon

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using sonication, mechanical agitation, microfluidic devices, or homogenization. Recently, lipid-based oxygen microbubbles (LOMs) have been designed to deliver oxygen intravenously during medical emergencies, reversing life-threatening hypoxemia, and preventing subsequent organ injury, cardiac arrest, and death. We present methods for scaled-up production of highly oxygenated microbubbles using a closed-loop high-shear homogenizer. The process can produce 2 L of concentrated LOMs (90% by volume) in 90 min. Resulting bubbles have a mean diameter of ~2 &#956;m, and a rheologic profile consistent with that of blood when diluted to 60 volume %. This technique produces LOMs in high capacity and with high oxygen purity, suggesting that this technique may be useful for translational research labs.

We describe methods for the manufacture of large volumes of lipid-based oxygen microbubbles (LOMs) designed for intravenous oxygen delivery using high-shear homogenization and serial concentration.

Yüksek homojenizasyon ve Seri Konsantrasyon konsantre, Lipid-tabanlı Oksijen Mikro Emülsiyonlar imalatı

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Microtoroid Optik Rezonatörler Kullanarak Etiket serbest Tek Molekül Algılama

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic resonance (MR) microscopy data. While it is possible to perform MR collections on living, excised mammalian tissue, such experiments have traditionally been constrained by resolution limits and are thus incapable of visualizing tissue microstructure. Conversely, MR protocols that did achieve microscopic image resolution required the use of fixed samples to accommodate the need for static, unchanging conditions over lengthy scan times. The current protocol describes the first available MR technique that enables imaging of living, mammalian tissue samples at microscopic resolutions. Such data is of great importance to the understanding of how pathology-based contrast changes occurring at the microscopic level influence the content of macroscopic MR scans such as those used in the clinic. Once such an understanding is realized, diagnostic methods with greater sensitivity and accuracy can be developed, which will translate directly to earlier disease treatment, more accurate therapy monitoring and improved patient outcomes.
While the described methodology focuses on brain slice preparations, the protocol is adaptable to any excised tissue slice given that changes are made to the gas and perfusate preparations to accommodate the tissue&#39;s specific metabolic needs. Successful execution of the protocol should result in living, acute slice preparations that exhibit MR diffusion signal stability for periods up to 15.5 h. The primary advantages of the current system over other MR compatible perfusion apparatuses are its compatibility with the MR microscopy hardware required to attain higher resolution images and ability to provide constant, uninterrupted flow with carefully regulated perfusate conditions. Reduced sample throughput is a consideration with this design as only one tissue slice may be imaged at a time.

The current protocol describes a method by which users can maintain viability of acute hippocampal and cortical slice preparations during the collection of magnetic resonance microscopy data.

Metabolik destek çıkardım, yaşam beyin dokuları manyetik rezonans mikroskobu Alım sırasında

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...