Ce travail a été soutenu par les subventions R01GM080376, R35GM118139 et NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: 15-48571 à Y.E.G., et par une bourse nrsa pré-doctorale NIAID F30AI114187 à R.M.J.

REMARQUE: Toutes les étapes peuvent être effectuées dans l’espace de laboratoire général.
1. Nettoyage des lamaux de couverture en verre
<ol><li>Pour fournir une surface propre pour le dépôt par évaporation de particules colloïdales, placez des lamelle de verre borosilicate optique de 24 x 30 mm (épaisseur de 0,16 à 0,19 mm) dans les inserts rainurés d’un bocal de coloration en verre coplin pour le nettoyage. REMARQUE: Assurez-vous que les lamures de couverture sont verticales et bien séparées afin que toutes les surfaces soient clairement exposées pendant le processus de nettoyage.</li>
	<li>Verser suffisamment d’acétone dans le bocal de coloration pour couvrir les lamaux, placer le couvercle et soniquer pendant 10 min à 40 °C.</li>
	<li>Versez l’acétone et rincez les lamaux de couverture en remplissant le pot de coloration avec duH2O distillé et en versant l’eau. Répétez 2 fois de plus.</li>
	<li>Répétez la sonication de l’acétone (étapes 1.2 et 1.3) une fois de plus.</li>
	<li>Verser suffisamment de KOH de 200 mM dans le bocal pour couvrir les lamelle et soniquer, recouvert, pendant 20 min à 40 °C. REMARQUE: Le KOH grave légèrement le verre.</li>
	<li>Rincer les lamaux d’encré avec duH2O distillé 6 fois.</li>
	<li>Ajouter de l’éthanol pour couvrir les lamaux, ajouter le couvercle et soniquer pendant 10 min à 40 °C.</li>
	<li>Rincer les lamaux avec duH2O distillé 3 fois.</li>
	<li>Ramassez chaque lamelle au bord à l’aide de pinces douces et séchez les lamelle avec du gazN2. Ne touchez que les bords de la lamelle. Placez chacune des lamelle séchée et nettoyée dans une boîte de Pétri propre.</li>
</ol>2. Dépôt par évaporation de billes de polystyrène
<ol><li>Pour créer le masque à cristaux colloïdaux pour le réseau ZMW, centrifuger 50 μL de 1 μm de diamètre, des billes de polystyrène non fonctionnalisées (2,5 % p/v dans l’eau) à 15 000 x g,25 °C pendant 5 min. REMARQUE: Avant de pipetter les perles, la solution mère doit être brièvement vortexée au cas où les perles se seraient déposées au fond de la bouteille.</li>
	<li>Jetez le surnageant, en laissant le moins d’eau possible. REMARQUE: L’eau résiduelle peut modifier les propriétés d’évaporation de la remise en suspension de l’éthanol39,de sorte que l’élimination d’une petite quantité de billes afin d’éliminer toute l’eau est acceptable.</li>
	<li>Ressusciter les billes de l’étape 2.2 dans 50 μL de 1:400 TritonX-100:éthanol solvant. Pipetter de haut en bas plusieurs fois pour bien mélanger les perles avec le solvant. REMARQUE: TritonX-100: solvant éthanol doit être scellé avec un film de paraffine après utilisation et préparé frais une fois par mois. Les perles ont tendance à adhérer aux côtés d’un récipient en plastique, comme un tube à microcentrifugation, donc pipetter le long des côtés pour s’assurer que toutes les perles sont remises en suspension.</li>
	<li>Pour mettre en place une chambre d’humidité pour le dépôt, placez 6 boîtes de Pétri, chacune avec une lamelle de couverture, sur un banc dans une ligne avec des couvercles laissés légèrement entrouvertes. Dans chaque plat, déplacez la lamelle vers la région ouverte afin que les lamelle soient exposées à l’environnement lorsque l’humidité augmente à l’étape suivante.</li>
	<li>Placez un hygromètre et un petit ventilateur électrique centré derrière les boîtes de Pétri.</li>
	<li>Consigner l’humidité relative (HR) de départ en laboratoire. Remplissez un bécher de 200 mL avec 150−200 mL d’eau d’environ 75 °C et placez-le derrière le ventilateur.</li>
	<li>Allumez le ventilateur et couvrez les boîtes de Pétri, le ventilateur, le bécher et l’hygromètre d’un récipient de stockage en plastique transparent renversé (66 cm x 46 cm x 38 cm).</li>
	<li>Laissez l’HR dans la chambre s’élever à 70−75%, ce qui prend généralement 5−10 min. REMARQUE: Si l’HR ambiante en laboratoire est faible (inférieure à ~ 50%), laissez la chambre atteindre une HR plus élevée, mais pas plus élevée que 80%, pour compenser la perte d’humidité pendant le dépôt (voir ci-dessous).</li>
	<li>Lorsque l’HR atteint 70 à 75%, enregistrez l’HR et soulevez légèrement le récipient de stockage en plastique pour placer rapidement des couvercles sur les boîtes de Petri, ce qui empêche le mouillage trop humide des lamdes. REMARQUE: La température dans la chambre sera légèrement plus chaude que la température ambiante, généralement de 25−26 °C, à la suite de l’humidification. Si de l’humidité est visible sur les lamelle, les surfaces vitrées sont trop humides. Une boîte à gants commerciale pourrait simplifier cette partie du protocole.</li>
	<li>Que l’HR dans la chambre continue de monter à 85%. À ce stade, enregistrez l’HR dans la chambre d’humidité et pipettez 5 μL de la suspension de perles au centre de chaque lamelle.</li>
	<li>Fermez la chambre et les boîtes de Pétri après chaque dépôt pour minimiser la perte d’humidité. Visez à terminer les 6 dépôts dans un délai de 2 min.</li>
	<li>Enregistrer l’HR dans la chambre après la déposition. REMARQUE: L’HR après le dépôt aidera à évaluer à quelle vitesse l’humidité a été perdue pendant le dépôt, ce qui dépend des conditions ambiantes de laboratoire. Pour une course typiquement réussie, la chambre commencera à 85% HR avant le dépôt et se terminera à 70−75% HR après le dépôt.</li>
	<li>Laissez les gouttelettes de perles se propager et sécher pendant 5 min. REMARQUE: Si les cristaux colloïdaux ont de nombreux trous ou régions multicouches, alors la chambre était probablement trop humide ou sèche, respectivement. Ajuster l’humidité relative à laquelle fermer les boîtes de Pétri et commencer les dépôts (voir la section des résultats pour plus de détails sur l’optimisation).</li>
</ol>3. Recuit de perles pour réduire la taille des pores dans le modèle de cristal colloïdal
<ol><li>Pour fournir une surface de température uniforme pour le recuit des billes de polystyrène, qui rétrécit les inter-perles et arrondit les coins des interstices, placez une plaque d’aluminium plate et fraisée sur une plaque chauffante en céramique standard.</li>
	<li>Réglez la température de la plaque chauffante à 107 °C, la température de transition vitreuse du polystyrèneà 40. REMARQUE: Pour obtenir une température stable et précise, une sonde de thermocouple a été maintenue dans un trou de 2−3 mm de large et de 4−5 mm de profondeur dans la plaque d’aluminium.</li>
	<li>Placez une lamelle contenant le gabarit de perle sur la plaque d’aluminium chaud et recuit pendant 20 s (voir la section de discussion pour une explication du temps de fusion).</li>
	<li>Après le chauffage, retirez la lamelle de couverture de la plaque d’aluminium et placez-la rapidement sur une autre surface en aluminium à température ambiante pour la refroidir. REMARQUE: Il est utile d’avoir les lamelle de couverture suspendues légèrement sur le bord de la plaque ou de fraiser des canaux peu profonds (voir la vidéo d’accompagnement) dans la plaque pour faciliter le ramassage des lamaux de couverture.</li>
</ol>4. Nanofabrication de guides d’ondes en aluminium à mode zéro à l’aide du gabarit de cristal colloïdal
<ol><li>En utilisant un dépôt par évaporation thermique ou par faisceau d’électrons, déposez 300 nm de cuivre à 2 Å/s sur le gabarit de cristal colloïdal pour générer des poteaux dans les interstices entre les billes.</li>
	<li>Retirez l’excès de métal sur le dessus des perles en appuyant doucement sur la surface avec du ruban adhésif. Décollez lentement le ruban adhésif pour retirer le métal. REMARQUE: Quelques petites taches d’excès de métal réfléchissant peuvent rester après la traction du ruban, et celles-ci peuvent souvent être éliminées par un flux de gaz N2. S’il reste d’importantes taches d’excès de métal réfléchissant après la traction du ruban, essayez de tremper les gabarits dans du toluène pendant 2 h pour dissoudre partiellement les billes de polystyrène. Lavez les lamaux avec de l’eau distillée, séchez avecN2,et répétez la traction du ruban adhésif. Le trempage supplémentaire ne doit pas dissoudre complètement les perles, car les perles aident à protéger les poteaux des dommages pendant la traction du ruban adhésif.</li>
	<li>Pour dissoudre les billes de polystyrène, placez les modèles de perles dans du toluène et faites tremper pendant la nuit. ATTENTION : Les fumées de toluène peuvent être toxiques. Travaillez avec du toluène sous une cagoule bien ventilée et portez de l’équipement de protection individuelle, y compris des gants, des lunettes de sécurité et un sarrau de laboratoire. Le toluène doit être entreposé dans des armoires ventilées désignées pour les liquides inflammables.</li>
	<li>Après l’incubation du toluène, rincer les gabarits une fois avec du chloroforme et deux fois avec de l’éthanol. Manipulez soigneusement les lamaux de couverture à ce stade, car les délicats poteaux métalliques de 200−300 nm de haut sont maintenant exposés. Séchez les gabarits avec duN2 et éliminez les polymères résiduels et les contaminants dans un nettoyant à plasma d’oxygène pendant 30 min. ATTENTION : Les fumées de chloroforme peuvent être toxiques. Travaillez avec du chloroforme sous une hotte bien ventilée et portez de l’équipement de protection individuelle, y compris des gants, des lunettes de sécurité et un sarrau de laboratoire. Le chloroforme doit être conservé dans des armoires ventilées à l’écart des autres solvants inflammables.</li>
	<li>En utilisant un dépôt par évaporation thermique ou par faisceau d’électrons, déposez 3 nm d’une couche d’adhérence en titane à 1 Å/s suivie de 100−150 nm d’aluminium à 4 Å/s autour et au-dessus des poteaux en cuivre. REMARQUE: On peut utiliser un revêtement plus épais pour obtenir des guides plus profonds et une meilleure atténuation de la fluorescence de fond, mais cela diminue également le rendement après avoir exposé et dissous les poteaux à l’étape suivante (voir la section de discussion).</li>
	<li>Pour dissoudre les poteaux métalliques, tremper les lamaux de couverture dans l’etchant de cuivre (à base d’acide citrique; Table des matériaux) pendant 2 h. ATTENTION: L’antchant des métaux peut causer des brûlures de la peau. Travaillez avec des personnes-vêtements sous une hotte bien ventilée et portez un équipement de protection. Lavez-vous soigneusement les mains après la manipulation. L’etchant pour le métal doit être entreposé dans des armoires ventilées désignées pour les liquides corrosifs.</li>
	<li>Rincez les lamaux avec de l’eau distillée, séchez avecN2et polissez doucement la surface du revêtement métallique avec du papier à lentilles pour exposer tous les poteaux qui sont encore recouverts de revêtement. Replacez les lamaux de couverture dans un échant en cuivre pendant encore 2 h, puis rincez à nouveau à l’eau distillée et séchez avecN2. REMARQUE: Les lames ZMW doivent être stockées dans des boîtes de Pétri couvertes et propres pour les garder exemptes de contaminants.</li>
</ol>5. Nanofabrication de guides d’ondes en mode zéro or à l’aide du modèle de cristal colloïdal
REMARQUE : La méthode de fabrication des ZMW en or(figure supplémentaire 1),qui reflète le protocole de fabrication des ZMW en aluminium, est fournie dans cette section.
<ol><li>À l’aide d’un dépôt par évaporation par faisceau thermique ou par faisceau d’électrons, déposer 3 nm d’une couche d’adhérence en titane à 1 Å/s suivie de 300 nm d’aluminium à 4 Å/s.</li>
	<li>Retirez l’excès de métal sur le dessus des perles en appuyant doucement sur la surface avec du ruban adhésif. Décollez lentement le ruban adhésif pour retirer le métal.</li>
	<li>Pour dissoudre les billes de polystyrène, placez les modèles de perles dans du toluène et faites tremper pendant la nuit.</li>
	<li>Après l’incubation du toluène, rincer les gabarits une fois avec du chloroforme et deux fois avec de l’éthanol. Séchez les gabarits avec duN2 et éliminez les contaminants polymères résiduels dans un nettoyant à plasma d’oxygène pendant 30 min.</li>
	<li>En utilisant un dépôt par évaporation par faisceau thermique ou par faisceau d’électrons, déposez 100−150 nm d’or à 5 Å/s autour et au-dessus des poteaux en aluminium.</li>
	<li>Pour dissoudre les poteaux métalliques, trempez les lamaux de couverture dans de l’aluminium etchant (à base d’acide phosphorique; Table des matériaux) pendant 1 h.</li>
	<li>Rincez les lamaux avec de l’eau distillée, séchez avecN2et polissez doucement la surface du revêtement métallique avec du papier à lentilles pour exposer tous les poteaux qui sont encore recouverts de revêtement. Replacez les lamaux de couverture en aluminium pendant 1 h, puis rincez à nouveau à l’eau distillée et séchez avecN2. REMARQUE: Les lames ZMW doivent être stockées dans des boîtes de Pétri couvertes et propres.</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Pour l’auto-assemblage colloïdal (protocole section 2), l’utilisation d’éthanol plutôt que d’eau comme solvant de suspension accélère le processus d’évaporation de sorte que les gabarits soient prêts en 2−3 min après dépôt plutôt qu’en 1−2 h comme dans les méthodes précédentes48,49. Le protocole de sédimentation par évaporation présenté ici est également plus simple que les protocoles de sédimentation précédents qui nécessit...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.
Figure 3 was updated from:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.

Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Les techniques monomoléculaires telles que le transfert d’énergie de résonance de fluorescence à molécule unique (smFRET) ou la spectroscopie de corrélation de fluorescence à molécule unique (FCS) sont des outils puissants pour la biophysique moléculaire, permettant l’étude des mouvements dynamiques, des conformations et des interactions de biomolécules individuelles dans des processus tels que la transcription1,2,3,la traduction4,5,6,et bien d’autres7. Pour smFRET, la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) est une méthode courante car de nombreuses molécules attachées peuvent être suivies au fil du temps, et l’onde évanescente générée par TIR est limitée à une région de 100−200 nm adjacente à la la lamelle de couverture8. Cependant, même avec cette restriction sur le volume d’excitation, les fluorophores d’intérêt doivent encore être dilués dans des plages pM ou nM afin de détecter des signaux à molécule unique au-dessus de la fluorécence de fond9. Étant donné que les constantes de Michaelis-Menten des enzymes cellulaires se situent généralement dans la plage μM à mM10,les réactions biochimiques dans les études à molécule unique sont généralement beaucoup plus lentes que celles dans la cellule. Par exemple, la synthèse des protéines se produit à 15−20 acides aminés par seconde chez E. coli11,12, tandis que la plupart des ribosomes procaryotes dans les expériences smFRET se traduisent à 0,1−1 acide aminé par seconde13. Dans la synthèse des protéines, les structures cristallines et le smFRET sur les ribosomes bloqués ont montré que les ARN de transfert (ARNt) fluctuent entre les états « hybrides » et « classiques » avant l’étape de translocation ARNt-ARNm14,15. Cependant, lorsque des concentrations physiologiques du facteur GTPase de translocation, EF-G, étaient présentes, une conformation différente, intermédiaire entre les états hybride et classique, a été observée dans smFRET6. L’étude des processus moléculaires dynamiques à des taux et des concentrations similaires à ceux de la cellule est importante, mais reste un défi technique.
Une stratégie pour augmenter la concentration du substrat fluorescent est l’utilisation d’ouvertures de longueur d’onde sous-visibles à base de métal, appelées guides d’ondes à mode zéro (ZMW), pour générer des champs d’excitation confinés qui excitent sélectivement des biomolécules localisées dans les ouvertures16 (Figure 1). Les ouvertures sont généralement de 100−200 nm de diamètre et de 100−150 nm de profondeur17. Au-dessus d’une longueur d’onde de coupure liée à la taille et à la forme des puits (λc ≈ 2,3 fois le diamètre pour les guides d’ondes circulaires avec de l’eau comme milieu diélectrique18),aucun mode de propagation n’est autorisé dans le guide d’ondes, d’où le terme de guides d’ondes en mode zéro. Cependant, un champ électromagnétique oscillant, appelé onde évanescente, en décroissance exponentielle en intensité creuse encore des tunnels à une courte distance dans le guide d’ondes18,19. Bien que similaires aux ondes évanescentes TIR, les ondes évanescentes ZMW ont une constante de désintégration plus courte, ce qui entraîne une région d’excitation efficace de 10−30 nm dans le guide d’ondes. Aux concentrations micromolaires de ligands marqués par fluorescence, seulement une ou quelques molécules sont simultanément présentes dans la région d’excitation. Cette restriction du volume d’excitation et la réduction conséquente de la fluorescence de fond permettent l’imagerie par fluorescence de molécules uniques à des concentrations biologiquement pertinentes. Ceci a été appliqué à de nombreux systèmes20,notamment les mesures FCS de diffusion monoprotéique21,les mesures FRET à molécule unique des interactions ligand-protéine22 à faible affinité et protéine23,et les mesures spectro-électrochimiques des événements de renouvellement moléculaire unique24.
Les ZMW ont été produits en modelant directement une couche métallique à l’aide du fraisage par faisceau d’ions25,26 ou de la lithographie par faisceau d’électrons (EBL) suivie d’une gravure au plasma16,27. Ces méthodes de lithographie sans masque créent des guides d’ondes en série et nécessitent généralement l’accès à des installations de nanofabrication spécialisées, empêchant l’adoption généralisée de la technologie ZMW. Une autre méthode, la lithographie par nanoimpression ultraviolettelift-off 28, utilise un moule à lame de quartz pour presser un gabarit ZMW inverse sur un film de résistance comme un tampon. Bien que cette méthode soit plus rationalisée, elle nécessite toujours EBL pour la fabrication du moule à quartz. Cet article présente le protocole d’une méthode de fabrication par modèle simple et peu coûteuse qui ne nécessite pas d’EBL ou de fraisage par faisceau d’ions et est basée sur un emballage rapproché de nanosphères pour former un masque lithographique.
La nanosphère ou lithographie « naturelle », qui a été proposée pour la première fois en 1982 par Deckman et Dunsmuir29,30,utilise l’auto-assemblage de particules colloïdales monodisperses, allant de dizaines de nanomètres à des dizaines de micromètres31,pour créer des gabarits de motif de surface via la gravure et / ou le dépôt de matériaux. Les réseaux périodiques étendus bidimensionnels (2D) ou tridimensionnels (3D) de particules colloïdales, appelés cristaux colloïdaux, sont caractérisés par une iridescence brillante de diffusion et de diffraction32. Bien que moins largement utilisée que le faisceau d’électrons ou la photolithographie, cette méthodologie de masquage est simple, peu coûteuse et facilement réduite pour créer des tailles d’entités inférieures à 100 nm.
Diriger l’auto-assemblage de particules colloïdales détermine le succès de l’utilisation de cristaux colloïdaux comme masques pour le modelage de surface. Si la taille et la forme des particules sont homogènes, les particules colloïdales peuvent être facilement auto-assemblées avec un emballage hexagonal, entraîné par épuisement entropique33. L’évaporation de l’eau après dépôt est une voie efficace pour sédimenter les particules colloïdales, bien que d’autres méthodes comprennent le trempage-revêtement34,le spin-coating35,le dépôt électrophorétique36,et la consolidation à une interface air-eau37. Le protocole présenté ci-dessous est basé sur la méthode de sédimentation par évaporation, qui était la plus simple à mettre en œuvre. Les interstices triangulaires entre les billes de polystyrène serrées forment des ouvertures dans lesquelles plaquer un métal sacrificiel, formant des poteaux(figure 2 et figure supplémentaire 1). Un bref recuit des perles avant cette étape ajuste la forme et le diamètre de ces poteaux. Les perles sont enlevées, une dernière couche métallique est déposée autour des poteaux, puis les poteaux sont enlevés. Après les deux étapes de dépôt de métaux sur le nanomasque colloïdal, l’élimination des poteaux intermédiaires et la modification de la chimie de surface pour la passivation et l’attache, les réseaux ZMW sont prêts à être utilisés pour l’imagerie à molécule unique. Une caractérisation plus approfondie des propriétés optiques ZMW après fabrication peut être trouvée dans un article d’accompagnement38. Outre un évaporateur thermique pour le dépôt en phase vapeur des métaux, aucun outil spécialisé n’est nécessaire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:667px;" width="668">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1. Glass Coverslip Cleaning</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:231px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Acetone</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Coplin glass staining jar</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-817</td>
			<td>Staining jar with 8 grooves and molded glass cover</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Coverslips</td>
			<td style="width:103px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48404-467</td>
			<td>24 mm x 30 mm (No.1&#189;, Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Ethanol</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E7023</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">KOH</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R80115TS</td>
			<td>100 mm diameter, 15 mm deep</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Sonicator</td>
			<td style="width:103px;">Branson</td>
			<td style="width:119px;">Z245143</td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 5510</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Clear storage container</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-110-8222</td>
			<td>26 x 18 x 15 in.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Desk fan</td>
			<td style="width:103px;">O2Cool</td>
			<td style="width:119px;">FD05001A</td>
			<td>Any small desk (~5 in.) fan will work</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Glass beaker</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-555-25B</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Humidity meter</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-661-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21-402-903</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Polystyrene microspheres</td>
			<td style="width:103px;">Polysciences</td>
			<td style="width:119px;">18602-15</td>
			<td>1.00 &#181;m diameter, non-functionalized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Triton X-100 deturgent</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X100</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Aluminum plate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AA11062RY</td>
			<td>Customized in-house to 14 cm x 14 cm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Ceramic hotplate</td>
			<td style="width:103px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">HP88857100</td>
			<td>13 x 8.2 x 3.8 in.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Temperature controller</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">38615K71</td>
			<td>Read temperature with thermocouple probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Thermocouple probe</td>
			<td style="width:103px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">9251T93</td>
			<td>Type K, surface probe</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">Type A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Aluminum pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAL40QXHB</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Chloroform</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper etchant</td>
			<td style="width:103px;">Transene</td>
			<td style="width:119px;">49-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Copper pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMCU40QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Gold pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMAUXX40G</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Lens paper</td>
			<td style="width:103px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:119px;">MC-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:103px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:119px;">PDC-32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:103px;">Staples</td>
			<td style="width:119px;">MMM119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Thin film deposition system</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">PVD-75</td>
			<td>Tabletop thermal evaporation system will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Titanium pellets</td>
			<td style="width:103px;">Kurt J. Lesker</td>
			<td style="width:119px;">EVMTI45QXQA</td>
			<td>For electron beam evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Toluene</td>
			<td style="width:103px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">244511</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Representative Results</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">COMSOL Multiphysics Modeling Software</td>
			<td>COMSOL, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">Dual View spectral splitter</td>
			<td style="width:103px;">Photometrics, Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy

En enzymologie de fluorescence à molécule unique, la fluorescence de fond à partir de substrats marqués en solution limite souvent la concentration de fluorophores à des plages pico- à nanomolaires, plusieurs ordres de grandeur inférieures à de nombreuses concentrations physiologiques de ligands. Les nanostructures optiques appelées guides d’ondes en mode zéro (ZMW), qui ont des ouvertures de 100−200 nm de diamètre fabriquées dans un métal conducteur mince tel que l’aluminium ou l’or, permettent l’imagerie de molécules individuelles à des concentrations micromolaires de fluorophores en limitant l’excitation de la lumière visible à des volumes efficaces zéptolitres. Cependant, le besoin d’équipements de nanofabrication coûteux et spécialisés a empêché l’utilisation généralisée des ZMW. En règle générale, les nanostructures telles que les ZMW sont obtenues par écriture directe à l’aide de la lithographie par faisceau d’électrons, qui est séquentielle et lente. Ici, colloïdale, ou nanosphère, la lithographie est utilisée comme une stratégie alternative pour créer des masques à l’échelle nanométrique pour la fabrication de guides d’ondes. Ce rapport décrit l’approche en détail, avec des considérations pratiques pour chaque phase. La méthode permet de faire des milliers de ZMW en aluminium ou en or en parallèle, avec des diamètres et des profondeurs de guide d’ondes finaux de 100−200 nm. Seuls l’équipement de laboratoire commun et un évaporateur thermique pour le dépôt de métaux sont requis. En rendant les ZMW plus accessibles à la communauté biochimique, cette méthode peut faciliter l’étude des processus moléculaires aux concentrations et aux taux cellulaires.

L’auto-assemblage des particules colloïdales de polystyrène par sédimentation par évaporation (étapes 2.1 à 2.13) peut produire une gamme de résultats puisqu’il nécessite un contrôle du taux d’évaporation du solvant. Cependant, comme les dépôts sont rapides (10 à 15 min par tour), la procédure peut être rapidement optimisée pour différentes conditions ambiantes de laboratoire. La figure 3A montre un gabarit colloïdal bien formé après dépôt et évaporation. Macrosc...

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Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Décrit ici est une méthode de lithographie de nanosphère pour la fabrication parallèle de guides d’ondes en mode zéro, qui sont des réseaux de nanoapertures dans une lame de couverture de microscopie en verre revêtu de métal pour l’imagerie à molécule unique à des concentrations nano- à micromolaires de fluorophores. La méthode tire parti de l’auto-assemblage de cristaux colloïdaux pour créer un modèle de guide d’ondes.

Fabrication de guides d’ondes en mode zéro pour la microscopie à molécule unique à haute concentration

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

fabrication-zero-mode-waveguides-for-high-concentration-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.8K vues.  University of Pennsylvania. Décrit ici est une méthode de lithographie de nanosphère pour la fabrication parallèle de guides d’ondes en mode zéro, qui sont des réseaux de nanoapertures dans une lame de couverture de microscopie en verre revêtu de métal pour l’imagerie à molécule unique à des concentrations nano- à micromolaires de fluorophores. La méthode tire parti de l’auto-assemblage de cristaux colloïdaux pour créer un modèle de guide d’ondes.

Vidéo: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

Low-Cost Cryo-Lumière de fabrication étape par microscopie lumineuse corrélées / Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Recherche

Bio-ingénierie

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplexée unique molécule mesures Protéolyse forcer l&#39;utilisation de pinces magnétiques

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Fabrication of Carbon Nanotube High-Frequency Nanoelectronic Biosensor for Sensing in High Ionic Strength Solutions

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them good candidates for high sensitivity biosensors. When a charged molecule binds to such a sensor surface, it alters the carrier density5 in the sensor, resulting in changes in its DC conductance. However, in an ionic solution a charged surface also attracts counter-ions from the solution, forming an electrical double layer (EDL). This EDL effectively screens off the charge, and in physiologically relevant conditions ~100 millimolar (mM), the characteristic charge screening length (Debye length) is less than a nanometer (nm). Thus, in high ionic strength solutions, charge based (DC) detection is fundamentally impeded6-8.
We overcome charge screening effects by detecting molecular dipoles rather than charges at high frequency, by operating carbon nanotube field effect transistors as high frequency mixers9-11. At high frequencies, the AC drive force can no longer overcome the solution drag and the ions in solution do not have sufficient time to form the EDL. Further, frequency mixing technique allows us to operate at frequencies high enough to overcome ionic screening, and yet detect the sensing signals at lower frequencies11-12. Also, the high transconductance of SWNT transistors provides an internal gain for the sensing signal, which obviates the need for external signal amplifier.
Here, we describe the protocol to (a) fabricate SWNT transistors, (b) functionalize biomolecules to the nanotube13, (c) design and stamp a poly-dimethylsiloxane (PDMS) micro-fluidic chamber14 onto the device, and (d) carry out high frequency sensing in different ionic strength solutions11.

We describe the device fabrication and measurement protocol for carbon nanotube based high frequency biosensors. The high frequency sensing technique mitigates the fundamental ionic (Debye) screening effect and allows nanotube biosensor to be operated in high ionic strength solutions where conventional electronic biosensors fail. Our technology provides a unique platform for point-of-care (POC) electronic biosensors operating in physiologically relevant conditions.

Fabrication de nanotubes de carbone à haute fréquence Nanoélectronique biocapteur pour détecter en haute force ionique

The unique electronic properties and high surface-to-volume ratios of single-walled carbon nanotubes (SWNT) and semiconductor nanowires (NW) 1-4 make them ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

Microfluidique picolitres bioréacteur pour Analyse microbienne unicellulaire: Fabrication, configuration du système, et l&#39;opération

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Enquêter sur les systèmes récepteur-ligand de la cellulosome avec base-AFM unique molécule Spectroscopie de Force

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Manufacture of Concentrated, Lipid-based Oxygen Microbubble Emulsions by High Shear Homogenization and Serial Concentration

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using sonication, mechanical agitation, microfluidic devices, or homogenization. Recently, lipid-based oxygen microbubbles (LOMs) have been designed to deliver oxygen intravenously during medical emergencies, reversing life-threatening hypoxemia, and preventing subsequent organ injury, cardiac arrest, and death. We present methods for scaled-up production of highly oxygenated microbubbles using a closed-loop high-shear homogenizer. The process can produce 2 L of concentrated LOMs (90% by volume) in 90 min. Resulting bubbles have a mean diameter of ~2 &#956;m, and a rheologic profile consistent with that of blood when diluted to 60 volume %. This technique produces LOMs in high capacity and with high oxygen purity, suggesting that this technique may be useful for translational research labs.

We describe methods for the manufacture of large volumes of lipid-based oxygen microbubbles (LOMs) designed for intravenous oxygen delivery using high-shear homogenization and serial concentration.

Fabrication de concentré, de l&#39;oxygène à base de lipides microbulles émulsions par cisaillement élevé homogénéisation et la concentration de série

Gas-filled microbubbles have been developed as ultrasound contrast and drug delivery agents. Microbubbles can be produced by processing surfactants using ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Haute résolution spatio-temporelle d&#39;analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Bilayers seule molécule microscopie à fluorescence sur Planar pris en charge

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Simple détection de molécule libre Label-Utilisation Microtoroid optiques résonateurs

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic resonance (MR) microscopy data. While it is possible to perform MR collections on living, excised mammalian tissue, such experiments have traditionally been constrained by resolution limits and are thus incapable of visualizing tissue microstructure. Conversely, MR protocols that did achieve microscopic image resolution required the use of fixed samples to accommodate the need for static, unchanging conditions over lengthy scan times. The current protocol describes the first available MR technique that enables imaging of living, mammalian tissue samples at microscopic resolutions. Such data is of great importance to the understanding of how pathology-based contrast changes occurring at the microscopic level influence the content of macroscopic MR scans such as those used in the clinic. Once such an understanding is realized, diagnostic methods with greater sensitivity and accuracy can be developed, which will translate directly to earlier disease treatment, more accurate therapy monitoring and improved patient outcomes.
While the described methodology focuses on brain slice preparations, the protocol is adaptable to any excised tissue slice given that changes are made to the gas and perfusate preparations to accommodate the tissue&#39;s specific metabolic needs. Successful execution of the protocol should result in living, acute slice preparations that exhibit MR diffusion signal stability for periods up to 15.5 h. The primary advantages of the current system over other MR compatible perfusion apparatuses are its compatibility with the MR microscopy hardware required to attain higher resolution images and ability to provide constant, uninterrupted flow with carefully regulated perfusate conditions. Reduced sample throughput is a consideration with this design as only one tissue slice may be imaged at a time.

The current protocol describes a method by which users can maintain viability of acute hippocampal and cortical slice preparations during the collection of magnetic resonance microscopy data.

Soutien métabolique des excisées, les tissus de cerveau vivants lors de l’Acquisition de la microscopie par résonance magnétique

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...