この研究は、NIH助成金R01GM080376、R35GM118139、NSFメカノバイオロジーCMMI:15-48571からY.E.G.、およびNIAIDの博士前NRSAフェローシップF30AI114187によってサポートされました.M

注: すべての手順は、一般的なラボスペースで完了できます。
1. ガラスカバースリップクリーニング
<ol><li>コロイド粒子の蒸発堆積のためのきれいな表面を提供するために、24 x 30 mmの光学ホウケイ酸ガラスカバーリップ(0.16-0.19 mm厚さ)を、コプリンガラス染色瓶の溝付きインサート内に配置して洗浄します。 注: クリーニングプロセス中にすべての表面がはっきりと露出するように、カバーリップが直立し、十分に分離されていることを確認してください。</li>
	<li>染色瓶に十分なアセトンを注ぎ、カバーを覆い、カバーを置き、40°Cで10分間超音波処理します。</li>
	<li>アセトンを注ぎ、染色した瓶に蒸留したH2Oを充填し、水を注いでカバーリップをすすいだ。さらに2回繰り返します。</li>
	<li>アセトン超音波処理(ステップ1.2と1.3)をもう一度繰り返します。</li>
	<li>40°Cで20分間カバーリップと超音波処理をカバーするのに十分な200 mM KOHを瓶に注ぎます。 注:KOHはガラスを少しエッチングします。</li>
	<li>蒸留したH2Oを6回でカバーリップをすすいでください。</li>
	<li>カバーリップを覆うエタノールを加え、蓋を加え、40°Cで10分間超音波処理します。</li>
	<li>蒸留したH2Oを3回でカバーリップをすすいでください。</li>
	<li>穏やかな鉗子を使用して端の各カバースリップを拾い、N2 ガスでカバースリップを乾燥させる。カバースリップの端だけをタッチします。乾燥した洗浄されたカバーリップをそれぞれ、個々のきれいなペトリ皿に入れます。</li>
</ol>2. ポリスチレンビーズの蒸発蒸着
<ol><li>ZMWアレイ用のコロイド結晶マスクを作成するために、直径1μmの遠心分離機50μL、非機能化ポリスチレンビーズ(水中2.5%w/v)を15,000xg、25°Cで5分間作成した。 注:ビーズをピペットする前に、ビーズがボトルの底に落ち着いた場合に備えて、ストック液を短時間渦に入れる必要があります。</li>
	<li>上清を捨て、残りの水はできるだけ少なくします。 注:残留水はエタノール再懸濁液39の蒸発特性を変化させることができるので、すべての水を除去するために少量のビーズを除去することは許容される。</li>
	<li>ステップ2.2からビーズを50 μLの1:400 TritonX-100:エタノール溶媒で再懸濁します。ピペットを数回上下にして、ビーズと溶媒を完全に混合します。 注:TritonX-100:エタノール溶媒は、使用後パラフィンフィルムで密封し、月に一度新鮮に調製する必要があります。ビーズは、マイクロ遠心チューブなどのプラスチック容器の側面に付着する傾向があるため、側面に沿ってピペットがすべてのビーズを再懸濁するようにします。</li>
	<li>堆積のための湿度室を設置するには、蓋がわずかにアジャールを残したラインのベンチに、それぞれ1つのカバースリップを備えた6ペトリ皿を置きます。各皿で、次のステップで湿度が上がったときにカバーリップが環境にさらされるように、カバースリップを開いた領域に移動させます。</li>
	<li>ペトリ皿の後ろに湿度計と小さな扇風機を置きます。</li>
	<li>開始相対湿度 (RH) をラボに記録します。200 mL ビーカーに約75°Cの水150~200 mLを充填し、ファンの後ろに置きます。</li>
	<li>ファンの電源を入れ、ペトリ皿、ファン、ビーカー、湿度計を覆い、透明なプラスチック製の収納容器(66cm x 46 cm x 38 cm)で覆います。</li>
	<li>チャンバー内のRHを70-75%に上昇させ、通常は5-10分かかります。 注:アンビエントラボRHが低い(〜50%未満)場合は、チャンバーが高いRHに到達しますが、堆積中の湿度の損失を補うために80%以下にします(下記参照)。</li>
	<li>RHが70-75%に達したら、RHを記録し、プラスチック製の貯蔵容器をわずかに持ち上げて、カバーをペトリ皿に素早く置き、カバースリップの過度の濡れを防ぎます。 注: チャンバー内の温度は、加湿の結果として室温(通常は25-26 °C)よりもわずかに暖かくなります。カバーリップに水分が見える場合は、ガラス表面が濡れ過ぎる。商用グローブボックスは、プロトコルのこの部分を簡素化する可能性があります。</li>
	<li>チャンバー内のRHは85%まで上昇し続けます。その時点で、湿度チャンバにRHを記録し、各カバースリップの中央にビーズサスペンションのピペット5μLを記録します。</li>
	<li>湿度の損失を最小限に抑えるために、各堆積物の後にチャンバーとペトリ皿を閉じます。2分以内に6つの堆積物をすべて仕上げるようにしてください。</li>
	<li>堆積後のチャンバーにRHを記録します。 注: 堆積後の RH は、周囲の実験室の条件に依存する堆積中にどのくらいの速さで湿度が失われたかを測定するのに役立ちます。典型的な成功した走行のために、チャンバは堆積の前に85%RHで始まり、堆積後70-75%RHで終わる。</li>
	<li>ビーズの液滴を広げて5分間乾燥させます。 注:コロイド結晶が多くの穴や多層領域を持っている場合、チャンバーはそれぞれ湿度が高すぎたか乾燥している可能性があります。ペトリ皿を閉じる相対湿度を調整し、堆積を開始します(最適化の詳細については、結果セクションを参照)。</li>
</ol>3. コロイド結晶テンプレートで毛穴のサイズを小さくするためのビーズアニーリング
<ol><li>ビーズ間のインタースティックスを狭め、インタースティックスのコーナーを丸めるポリスチレンビーズのアニーリングのための均一な温度表面を提供するために、標準的なセラミックホットプレートの上に平らな、粉砕されたアルミニウム板を置きます。</li>
	<li>ホットプレートの温度を107°Cに設定し、ポリスチレン40のガラス転移温度に設定する。 注: 安定した正確な温度を得るために、熱電対プローブは幅2~3mm、アルミニウム板の深さ4~5mmの穴に保持されています。</li>
	<li>ホットアルミプレートにビーズテンプレートを含むカバースリップを20sのアニールに置きます(融解時間の説明については、説明セクションを参照)。</li>
	<li>加熱後、カバースリップをアルミニウム板から取り出し、速やかに別の室温アルミニウム表面に置いて冷却します。 注:カバーリップのピックアップを容易にするために、カバーリップがプレートの端に少し掛かっているか、またはプレートに浅いチャネル(付属のビデオを参照)を持っている方が便利です。</li>
</ol>4. コロイド結晶テンプレートを用いたアルミニウムゼロモードの導波管のナノファブリケーション
<ol><li>熱または電子ビーム蒸発堆積を使用して、300nmの銅をコロイド結晶テンプレート上に2Å/sに堆積させ、ビーズ間補間にポストを生成します。</li>
	<li>テープで表面を軽く押して、ビーズの上に余分な金属を取り除きます。テープをゆっくりと剥がして金属を引き離します。 注:テーププル後に反射過剰な金属の小さなパッチが残ることがあり、これらはしばしばN2 ガスの流れによって除去することができます。テーププル後に反射過剰金属の相当なパッチが残っている場合は、ポリスチレンビーズを部分的に溶解させるために2時間トルエンにテンプレートを浸してみてください。カバーリップを蒸留水で洗い、N2で乾かしてからテープを引き抜きます。追加の浸漬は、ビーズがテーププル中の損傷からポストを保護するのに役立つため、ビーズを完全に溶解しないでください。</li>
	<li>ポリスチレンビーズを溶解するには、ビーズテンプレートをトルエンに入れ、一晩浸します。 注意:トルエン煙は有毒である可能性があります。換気の良いフードの下でトルエンを使用し、手袋、安全メガネ、ラボコートなどの個人用保護具を着用してください。トルエンは、可燃性液体用に指定された換気キャビネットに保管する必要があります。</li>
	<li>トルエンインキュベーション後、テンプレートをクロロホルムで1回、エタノールで2回リンスします。繊細な200-300 nmの高さの金属の柱が露出しているので、この時点で慎重にカバーリップを扱います。テンプレートをN2 で乾燥させ、酸素プラズマクリーナーの残留ポリマーと汚染物質を30分間除去します。 注意:クロロホルムの煙は有毒である可能性があります。換気の良いフードの下でクロロホルムを使用し、手袋、安全メガネ、ラボコートなどの個人用保護具を着用してください。クロロホルムは、他の可燃性溶剤から離れた換気キャビネットに保管する必要があります。</li>
	<li>熱または電子ビーム蒸着を使用して、チタン付着層の3nmを1Å/sに堆積させ、その後、銅ポストの周りと上に4Å/ sで100-150 nmのアルミニウムを堆積させます。 注:より厚いクラッディングを使用して、より深いガイドを取得し、バックグラウンド蛍光をより良く減衰させることができますが、これはまた、次のステップで投稿を公開して溶解した後の収量を減少させます(説明セクションを参照)。</li>
	<li>金属ポストを溶解するには、カバーリップを銅エッチャント(クエン酸ベース)に浸します。 資料一覧)2時間。 注意:金属エッチャントは皮膚の火傷を引き起こす可能性があります。換気の良いフードの下でエッチャントを使用し、保護具を着用してください。取扱い後は手を十分に洗ってください。金属エッチャントは、腐食性液体用に指定された換気されたキャビネットに保管する必要があります。</li>
	<li>カバーリップを蒸留水でリンスし、N2で乾燥させ、レンズペーパーで金属クラッディングの表面を軽くバフして、クラッディングで覆われているポストを露出させます。カバースリップを別の2時間銅エッチャントに戻し、蒸留水で再びすすいでN2で乾燥させます。 注:ZMWのスライドは、汚染物質を含まないそれらを保つために、覆われた、きれいなペトリ皿に保存する必要があります。</li>
</ol>5. コロイド結晶テンプレートを用いた金ゼロモードの導波管のナノファブリケーション
注: アルミニウム ZMWs を製造するためのプロトコルを反映したゴールド ZMW (補足図 1)を製造する方法は、このセクションで提供されています。
<ol><li>熱または電子ビーム蒸発堆積を使用して、チタン付着層の3nmを1Å/sに堆積させ、その後4Å/sで300nmのアルミニウムを堆積させます。</li>
	<li>テープで表面を軽く押して、ビーズの上に余分な金属を取り除きます。テープをゆっくりと剥がして金属を引き離します。</li>
	<li>ポリスチレンビーズを溶解するには、ビーズテンプレートをトルエンに入れ、一晩浸します。</li>
	<li>トルエンインキュベーション後、テンプレートをクロロホルムで1回、エタノールで2回リンスします。テンプレートをN2 で乾燥させ、酸素プラズマクリーナーの残留ポリマー汚染物質を30分間除去します。</li>
	<li>熱ビームまたは電子ビーム蒸発堆積を使用して、アルミニウムポストの周りおよび上に5 Å /sで金の100-150 nmを堆積させます。</li>
	<li>金属ポストを溶解するには、カバーリップをアルミニウムエッチャント(リン酸ベース)に浸します。 資料一覧)1時間。</li>
	<li>カバーリップを蒸留水でリンスし、N2で乾燥させ、レンズペーパーで金属クラッディングの表面を軽くバフして、クラッディングで覆われているポストを露出させます。カバースリップをアルミニウムエチャントに1時間戻し、蒸留水で再びすすいでN2で乾燥させます。 注:ZMWのスライドは、覆われた、きれいなペトリ皿に格納する必要があります。</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

コロイド自己集合(プロトコルセクション2)では、懸濁溶媒として水ではなくエタノールを使用すると、以前の方法48,49のように、テンプレートが1−2時間ではなく、堆積後2〜3分で準備ができるように、蒸発プロセスを高速化する。ここで提示される蒸発沈積分プロトコルは、サスペンション49、50、51以上の表面傾斜、温度、および空気量を制御する必要がある以前の堆積物プロトコルよりも簡単である。このプロトコルで使用される粒子体積分率は2.4%であり、以前の沈降法48で使用されていた0.2-0.5%よりも高く、水グリセロール混合物中のコロイドを再懸濁して、はるかに長いセトリングタイムスケールを行う。しかし、堆積物の品質は粒子体積分率の変化に強く、過去の研究では2-10%49、50、51の間で変化させることができることが分かりました。このプロトコルから正常に堆積して得られたコロイド結晶の粒径は、20-30μmで、以前の堆積方法(通常は数百ナノメートル)48,49の粒子よりも大きい。マクロ的には、コロイド単層の直径約2cmの領域も、前の方法49によって生成された1cmの領域に匹敵する。この方法で作られるコロイド結晶テンプレートの大きいサイズはまた3-5分離された流れの部屋44、各ZMWのスライドで作られるのは、それぞれ約3-4 mm幅を可能にする。これにより、複数の独立した単一分子実験を各スライドに対して行うことができる。
自己組立後にコロイドビーズテンプレート(プロトコルセクション3)をアニーリングすることは簡単ですが、ZMWsで背景蛍光を十分に低減するための重要なステップです。 補足図2 が示すように、アンネル化されていないテンプレートからの三角断面を有する導波管の有効カットオフ波長は894nmである。これに対して、アニールテンプレートから130nm径の円波導路に対する有効カットオフ波長は221nmであり、分析的に(ガイド18の直径の1.7倍)と数値的に決定される。堆積のために小さなビーズを使用すると、テンプレートの孔のサイズを小さくすることもできますが、導波ガイドは、可視光の回折限界の周りにある200 nmよりも近くに間隔を置きます。さらに、導波管は断面の三角形のままで、導波路を通して非対称の電力伝達を導く(補足図2A−D)。アニーリングステップの欠点の1つは、融解時間の変動が導波管径の変動を引き起こす可能性があるため、正確なタイミングがバッチ間の変動を最小限に抑えるのに役立ちます。インタースティスは25sよりも長いアニーリング時間で閉じ始め、ポスト直径は20-25 sの間であまり減少しません(補足図3B-D)。インタースティスクロージャーの簡単なテストは、アニールされたテンプレートが光で照らされ、斜めで見たときに虹回折パターンを生成するかどうかを確認することです。そうでなければ、インタースティックの大部分が閉じている可能性が高いです。アニーリング時間と典型的な孔径の関係は、38以前に提示されています。
アニーリングステップ中に所望の孔サイズを達成した後、銅は、マスクの影を作成するためにテンプレート上に(ステップ4.1)堆積されます。金属ができるだけ垂直にテンプレートに近づくと、視線堆積を使用することが重要です。したがって、サンプルと金属源との距離を長くすると、テンプレートを保持するプレートが回転しないように、いくつかの蒸気堆積機で自動的に行われるように、ポリスチレン基板上の金属の横面堆積を最小限に抑える際に役立ちます。しかし、いくつかの横方向の堆積は避けられず、これは間質孔のサイズを小さくし、したがって、より多くの金属が52に堆積するにつれてポスト断面を減少させる。この結果、プリズムのような構造の方がピラミッド型の金属ポストが 52になります。
銅の柱はプリズムの形ではなくピラミッド状である可能性が高いため、ポストの上にアルミニウム堆積(ステップ4.5)も傾斜した側面の一部をカバーし、一部のポストの銅エッチャントのアクセシビリティをブロックします。したがって、レンズ用紙のバフ処理ステップ(ステップ4.7または5.7)をエッチャントに最初に浸した後に添加し、アルミニウムで覆われた銅のポストを機械的に破壊した。より高いポストを作成するためにより多くの銅を堆積させることはまた、レンズ用紙のバフリング中に機械的な混乱の影響を受けやすいポストを作る。しかし、500nm以上の銅は、堆積の目標は、1μmビーズの500 nmの正中線に間質穴を投影することであるため、堆積すべきではありません。
もう 1 つの潜在的な難点は、レンズ用紙のバフリング中に意図しないアルミニウムクラッディングの除去です (ステップ 4.7 または 5.7)。また、アニール工程を加えた後に、焼鈍工程の添加によりアルミニウムクラッディングの損失がより頻繁に発生し、ポリスチレン残基の増加により、ガラスへのアルミニウム付着を妨げる可能性があることがわかった(プロトコルセクション3)。しかし、テーププル後の一晩トルエンの浸漬(ステップ4.3または5.3)は、この問題を解決しました。 図4EのAFM画像では、ポスト間にポリスチレンの残留リングが見えますが、アルミニウムクラッディングはステップ4.7で複数のバフに抵抗しました。アルミニウムクラッディングの損失が一晩トルエン浸漬後に問題のままである場合、RCA-1(標準クリーン-1)洗浄、ピラニア洗浄、またはさらなる酸素プラズマ洗浄をステップ4.4または5.4に添加することができる。これらの洗浄ステップは、ZMWsをさらに洗浄するために、最終エッチングステップ(ステップ4.7または5.7)の後、およびパッシベーション前に追加することもできます。
単一分子FRET実験におけるZMWsの性能は、EBLで製造されたZMWsの性能と同様であった。Cy3標識DNAヘリカーゼローダータンパク質を溶液に標識した単一鎖DNAに対して単一分子FRETを行う以前の研究では(図6Aと同じドナーアクセプター配列)、FRETイベントは100 nM Cy5バックグラウンドで明確に識別可能で、1μMでは識別不可能であった(低いアクセプター微量シグナル)我々は、商業ZMWsを用いた以前の研究では、バックグラウンド濃度が1mM54の高い単分子FRETアクセプターシグナルが、我々および社内で製造されたZMWsを有する他の以前の研究42,53よりも高いと報告された。ZMWs間の信号からバックグラウンドへのパフォーマンスに関するさらなる議論は、ジャミオルコフスキら38.ZMW表面53と蛍光サンプルの非特異的相互作用は、特に溶液中の拡散蛍光種が大きな高分子である場合に、より高い濃度へのアクセスを制限する一般的な課題である。翻訳などの複雑な生化学的システムに関するZMWsの研究は、通常、100-250nM 55、56、57、58に無料蛍光基質濃度を制限している。ZMWsの意図された適用に関係なく、高濃度で許容可能なノイズ信号を維持するために、異なるシステムのためのパッシベーション方法の最適化が必要になる可能性があります。
全体的に見て、ここで提示される方法は、特殊なスキルや機器を必要としない、一度に多くのテンプレートの並列製作を可能にし、異なる金属でZMWsを製造するために適応することができます。本研究では、銅とアルミニウムをそれぞれアルミニウムと金で置換し、金のZMWsを製造した(補足図3)。これはアルミニウムではなく金のパッシベーション方法を使用する実験室にとって有利である。また、金ZMWは可視スペクトルの赤色領域で吸収する蛍光体の発光を増強することが示されているが、アルミニウムZMWは緑色領域59で吸収する蛍光色素の発光を増強する。今後、この方法で作製されたZMWsからの蛍光シグナル強度は、HF16,26,60を用いてZMW金属クラッディングの下のガラスにエッチングすることで増強される可能性がある。これは、フルオロフォア61をクエンチすることができる金属壁から遠く離れて固定化された生体分子をもたらします。さらに、開口の入り口下の励起照明強度には最大があり、これは単一分子発光を26,60に増強するために以前に利用されてきた。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61154">Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy</a>. A figure was updated.
Figure 3 was updated from:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2.jpg" /> 
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 &#181;m). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 &#181;m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61154/61154fig3v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

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Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

単一分子蛍光共鳴エネルギー伝達(smFRET)や単分子蛍光相関分光(FCS)などの単一分子技術は、分子生物物理学のための強力なツールであり、転写1、2、3、翻訳4、6などのプロセスにおける個々の生体分子の動的動き、立体構造、相互作用の研究を可能にする7。smFRETの場合、多くのテザード分子が経つ場合があり、TIRによって発生するエバネッセント波はカバースリップ8に隣接する100-200 nm領域に制限されるため、全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡は一般的な方法である。しかし、励起体積に関するこの制限があっても、背景蛍光9を超える単一分子シグナルを検出するためには、関心のある蛍光体をpMまたはnM範囲に希釈する必要がある。細胞酵素のミカエル-メンテン定数は、典型的にはμMからmM範囲10であるため、単一分子研究における生化学的反応は、通常、細胞内の反応よりもはるかに遅い。例えば、タンパク質合成は大腸菌11,12において1秒当たり15~20アミノ酸で起こり、smFRET実験における原核生物リボソームの大部分は、毎秒0.1~1アミノ酸で翻訳される。タンパク質合成において、失速リボソーム上の結晶構造およびsmFRETは、tRNA-mRNA転座ステップ14,15の前に「ハイブリッド」状態と「古典的」状態の間でRNA(tRNA)の転移が変動することを示した。しかし、転座GTPase因子の生理的濃度が、EF−G、存在した場合、異なる立体構造、ハイブリッド状態と古典状態との中間体が、smFRET6で観察された。細胞内と同様の速度と濃度で動的分子プロセスを研究することは重要ですが、技術的な課題は残っています。
蛍光基質濃度を高める戦略は、ゼロモード導波ガイド(ZMWs)と呼ばれる金属ベースのサブ可視波長開口を用いて、開口16内に局在する生体分子を選択的に励起する限定励起場を生成することである(図1)。開口部は通常、直径 100~200 nm、深さ17で 100~150 nm です。ウェルの大きさと形状に関連するカットオフ波長(λc≈、水を有する円形導管の直径の2.3倍の誘電媒体18)、導波路では伝播モードが認められません。しかし、振動電磁場は、エバネッセント波と呼ば、指数関数的に強度が減衰し、依然として導波管18,19に短い距離をトンネルする。TIRエバネッセント波と同様に、ZMWエバネッセント波は減衰定数が短く、導波路内で10〜30nm有効な励起領域を生じます。蛍光標識リガンドのマイクロモル濃度では、励起領域内に同時に存在する分子は1個または数個に過ぎない。この励起体積の制限とそれに伴うバックグラウンド蛍光の減少により、生物学的に関連する濃度で単一分子の蛍光イメージングが可能になります。これは、多くのシステム20に適用されているが、単一タンパク質拡散21のFCS測定、低親和性リガンドタンパク質22およびタンパク質タンパク質相互作用23の単一分子FRET測定、および単一分子ターンオーバーイベント24の分光電気化学的測定を含む。
ZMWsは、イオンビームミリング25、26または電子ビームリソグラフィ(EBL)を用いて金属層を直接パターン化し、続いてプラズマエッチング16、27を生成した。これらのマスクレスリソグラフィ法は、一連の導波ガイドを作成し、通常、ZMW技術の普及を防ぐために、特殊なナノファブリケーション施設へのアクセスを必要とします。もう一つの方法は、紫外線ナノインプリントリソグラフィーリフトオフ28、切手のようなレジストフィルムに逆ZMWテンプレートを押し込むために石英スライド型を使用する。この方法はより合理化されていますが、石英金型の製造にはEBLが必要です。本稿では、EBLやイオンビームミリングを必要とせず、リソグラフィマスクを形成するためにナノスフィアの密閉に基づく、シンプルで安価なテンプレート化された製造方法のプロトコルを紹介します。
1982年にDeckmanとDunsmuir29,30によって最初に提案されたナノスフィアまたは「天然」リソグラフィーは、数十ナノメートルから数十マイクロメートル31までの単分散コロイド粒子の自己集合体を使用して、エッチングおよび/または材料の堆積を介した表面パターニングのテンプレートを作成します。2次元(2D)または3次元(3D)コロイド粒子の拡張周期配列は、コロイド結晶と呼ばれ、散乱および回折32からの明るい虹彩を特徴とする。電子ビームやフォトリソグラフィよりも広く使用されていないが、このマスキング方法論は、シンプルで低コストで、100nm以下の特徴サイズを作成するために簡単に縮小されます。
コロイド粒子の自己集合性を導き、表面パターニング用のマスクとしてコロイド結晶を使用することの成功を決定します。粒子の大きさと形状が均質であれば、コロイド粒子は、六角形のパッキングで容易に自己組み立てすることができ、エントロピー枯渇33によって駆動される。滴下後の水蒸発はコロイド粒子を沈降させる有効な経路であるが、他の方法としては、ディップコート34、スピンコート35、電気泳動堆積36、空気水界面37での定着が挙げられる。以下に示すプロトコルは、最も簡単に実装された蒸発堆積物法に基づいています。密梱されたポリスチレンビーズ間の三角形の間間に、犠牲金属をプレートする開口部を形成し、ポストを形成する(図2 および 補足図1)。このステップの前にビーズの短いアニーリングは、これらのポストの形状と直径を調整します。ビーズが除去され、最終的な金属層がポストの周りに堆積し、ポストが削除されます。コロイドナノマスクへの2つの金属蒸着ステップ、中間ポストの除去、およびパッシベーションおよびテザリングのための表面化学修飾の後、ZMWアレイは単一分子イメージングに使用する準備ができています。製造後のZMW光学特性のより広範な特性は、添付の記事38で見つけることができます。金属の蒸着のための熱蒸発器のほかに、特別な用具は要求されない。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Glass Coverslip Cleaning&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Coplin glass staining jar</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-817</td><td>Staining jar with 8 grooves and molded glass cover</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR</td><td>48404-467</td><td>24 mm x 30 mm (No.1&amp;frac12;, Rectangular)</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>1 L</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>30603</td><td>Potassium hydroxide</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>R80115TS</td><td>100 mm diameter, 15 mm deep</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>Z245143</td><td>Tabletop ultrasonic cleaner, 5510</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Evaporative Deposition of Polystyrene Beads&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clear storage container</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-110-8222</td><td>26 x 18 x 15 in.</td></tr><tr><td>Desk fan</td><td>O2Cool</td><td>FD05001A</td><td>Any small desk (~5 in.) fan will work</td></tr><tr><td>Glass beaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-555-25B</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Humidity meter</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-661-19</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-402-903</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>Polystyrene microspheres</td><td>Polysciences</td><td>18602-15</td><td>1.00 &amp;micro;m diameter, non-functionalized</td></tr><tr><td>Triton X-100 deturgent</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Bead Annealing for Reducing Pore Size in the Colloidal Crystal Template&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminum plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA11062RY</td><td>Customized in-house to 14 cm x 14 cm</td></tr><tr><td>Ceramic hotplate</td><td>Fisher Scientific</td><td>HP88857100</td><td>13 x 8.2 x 3.8 in.</td></tr><tr><td>Temperature controller</td><td>McMaster-Carr</td><td>38615K71</td><td>Read temperature with thermocouple probe</td></tr><tr><td>Thermocouple probe</td><td>McMaster-Carr</td><td>9251T93</td><td>Type K, surface probe</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;4/5. Nanofabrication of Zero Mode Waveguides Using the Colloidal Crystal Template&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aluminum etchant</td><td>Transene</td><td>Type A</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum pellets</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMAL40QXHB</td><td>For electron beam evaporation</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>288306</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Copper etchant</td><td>Transene</td><td>49-1</td><td></td></tr><tr><td>Copper pellets</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMCU40QXQA</td><td>For electron beam evaporation</td></tr><tr><td>Gold pellets</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMAUXX40G</td><td>For electron beam evaporation</td></tr><tr><td>Lens paper</td><td>Thorlabs</td><td>MC-5</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Scotch tape</td><td>Staples</td><td>MMM119</td><td></td></tr><tr><td>Thin film deposition system</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>PVD-75</td><td>Tabletop thermal evaporation system will also work</td></tr><tr><td>Titanium pellets</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>EVMTI45QXQA</td><td>For electron beam evaporation</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sigma</td><td>244511</td><td>1 L</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Representative Results&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics Modeling Software</td><td>COMSOL, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dual View spectral splitter</td><td>Photometrics, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of zero mode waveguides for high concentration single molecule microscopy

単一分子蛍光エンミノロジーでは、溶液中の標識基質からのバックグラウンド蛍光は、多くの生理学的リガンド濃度よりも数桁少ない数桁のピコからナノモルの範囲に蛍光を制限することが多い。アルミニウムや金などの薄い導電金属で作られた直径100~200nmの直径開口であるゼロモード導波管(ZMWs)と呼ばれる光学ナノ構造は、可視光励起をゼプトリットル有効体積に限定することで、蛍光色素のマイクロモル濃度で個々の分子をイメージングすることができます。しかし、高価で特殊なナノファブリケーション装置の必要性は、ZMWsの広範な使用を妨げている。典型的には、ZMWsのようなナノ構造は、逐次的かつ遅い電子ビームリソグラフィを用いて直接書くことによって得られる。ここで、コロイド、またはナノスフィアは、導波路製作のためのナノメートルスケールマスクを作成する代替戦略として用いられる。このレポートでは、各フェーズの実際的な考慮事項と共に、アプローチについて詳しく説明します。この方法により、数千のアルミニウムまたはゴールドのZMWを並列に作成でき、最終的な導波管の直径と深さは100〜200nmです。金属蒸着用の一般的なラボ機器と熱蒸発器のみが必要です。生化学的コミュニティにZMWsをよりアクセスしやすくすることで、この方法は細胞の濃度と速度での分子プロセスの研究を容易にすることができます。

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Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy

ここでは、フルオロフォアのナノからミクロモル濃度で単分子イメージングのための金属張りのガラス顕微鏡カバースリップにおけるナノパーチャーの配列であるゼロモードの導波管の平行作製のためのナノスフィアリソグラフィー法を説明する。この方法は、コロイド結晶自己集合を利用して導波管テンプレートを作成します。

高濃度単一分子顕微鏡のためのゼロモード導波ガイドの作製

In single molecule fluorescence enzymology, background fluorescence from labeled substrates in solution often limits fluorophore concentration to pico- to ...

fabrication-zero-mode-waveguides-for-high-concentration-single

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.0K ビュー.  University of Pennsylvania. ここでは、フルオロフォアのナノからミクロモル濃度で単分子イメージングのための金属張りのガラス顕微鏡カバースリップにおけるナノパーチャーの配列であるゼロモードの導波管の平行作製のためのナノスフィアリソグラフィー法を説明する。この方法は、コロイド結晶自己集合を利用して導波管テンプレートを作成します。

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Fabrication of Silica Ultra High Quality Factor Microresonators

Whispering gallery resonant cavities confine light in circular orbits at their periphery.1-2 The photon storage lifetime in the cavity, quantified by the quality factor (Q) of the cavity, can be in excess of 500ns for cavities with Q factors above 100 million. As a result of their low material losses, silica microcavities have demonstrated some of the longest photon lifetimes to date1-2. Since a portion of the circulating light extends outside the resonator, these devices can also be used to probe the surroundings. This interaction has enabled numerous experiments in biology, such as single molecule biodetection and antibody-antigen kinetics, as well as discoveries in other fields, such as development of ultra-low-threshold microlasers, characterization of thin films, and cavity quantum electrodynamics studies.3-7
The two primary silica resonant cavity geometries are the microsphere and the microtoroid. Both devices rely on a carbon dioxide laser reflow step to achieve their ultra-high-Q factors (Q&gt;100 million).1-2,8-9 However, there are several notable differences between the two structures. Silica microspheres are free-standing, supported by a single optical fiber, whereas silica microtoroids can be fabricated on a silicon wafer in large arrays using a combination of lithography and etching steps. These differences influence which device is optimal for a given experiment.
Here, we present detailed fabrication protocols for both types of resonant cavities. While the fabrication of microsphere resonant cavities is fairly straightforward, the fabrication of microtoroid resonant cavities requires additional specialized equipment and facilities (cleanroom). Therefore, this additional requirement may also influence which device is selected for a given experiment.
Introduction
An optical resonator efficiently confines light at specific wavelengths, known as the resonant wavelengths of the device. 1-2 The common figure of merit for these optical resonators is the quality factor or Q. This term describes the photon lifetime (&tau;o) within the resonator, which is directly related to the resonator's optical losses. Therefore, an optical resonator with a high Q factor has low optical losses, long photon lifetimes, and very low photon decay rates (1/&tau;o). As a result of the long photon lifetimes, it is possible to build-up extremely large circulating optical field intensities in these devices. This very unique property has allowed these devices to be used as laser sources and integrated biosensors.10
A unique sub-class of resonators is the whispering gallery mode optical microcavity. In these devices, the light is confined in circular orbits at the periphery. Therefore, the field is not completely confined within the device, but evanesces into the environment. Whispering gallery mode optical cavities have demonstrated some of the highest quality factors of any optical resonant cavity to date.9,11 Therefore, these devices are used throughout science and engineering, including in fundamental physics studies and in telecommunications as well as in biodetection experiments. 3-7,12
Optical microcavities can be fabricated from a wide range of materials and in a wide variety of geometries. A few examples include silica and silicon microtoroids, silicon, silicon nitride, and silica microdisks, micropillars, and silica and polymer microrings.13-17 The range in quality factor (Q) varies as dramatically as the geometry. Although both geometry and high Q are important considerations in any field, in many applications, there is far greater leverage in boosting device performance through Q enhancement. Among the numerous options detailed previously, the silica microsphere and the silica microtoroid resonator have achieved some of the highest Q factors to date.1,9 Additionally, as a result of the extremely low optical loss of silica from the visible through the near-IR, both microspheres and microtoroids are able to maintain their Q factors over a wide range of testing wavelengths.18 Finally, because silica is inherently biocompatible, it is routinely used in biodetection experiments.
In addition to high material absorption, there are several other potential loss mechanisms, including surface roughness, radiation loss, and contamination loss.2 Through an optimization of the device size, it is possible to eliminate radiation losses, which arise from poor optical field confinement within the device. Similarly, by storing a device in an appropriately clean environment, contamination of the surface can be minimized. Therefore, in addition to material loss, surface scattering is the primary loss mechanism of concern.2,8
In silica devices, surface scattering is minimized by using a laser reflow technique, which melts the silica through surface tension induced reflow. While spherical optical resonators have been studied for many years, it is only with recent advances in fabrication technologies that researchers been able to fabricate high quality silica optical toroidal microresonators (Q&gt;100 million) on a silicon substrate, thus paving the way for integration with microfluidics.1
The present series of protocols details how to fabricate both silica microsphere and microtoroid resonant cavities. While silica microsphere resonant cavities are well-established, microtoroid resonant cavities were only recently invented.1 As many of the fundamental methods used to fabricate the microsphere are also used in the more complex microtoroid fabrication procedure, by including both in a single protocol it will enable researchers to more easily trouble-shoot their experiments.

We describe the use of a carbon dioxide laser reflow technique to fabricate silica resonant cavities, including free-standing microspheres and on-chip microtoroids. The reflow method removes surface imperfections, allowing long photon lifetimes within both devices. The resulting devices have ultra high quality factors, enabling applications ranging from telecommunications to biodetection.

シリカ超高品質ファクターMicroresonatorsの作製

Whispering gallery resonant cavities confine light in circular orbits at their periphery.1-2 The photon storage lifetime in the cavity, quantified by the ...

工学

Terahertz Microfluidic Sensing Using a Parallel-plate Waveguide Sensor

Refractive index (RI) sensing is a powerful noninvasive and label-free sensing technique for the identification, detection and monitoring of microfluidic samples with a wide range of possible sensor designs such as interferometers and resonators 1,2. Most of the existing RI sensing applications focus on biological materials in aqueous solutions in visible and IR frequencies, such as DNA hybridization and genome sequencing. At terahertz frequencies, applications include quality control, monitoring of industrial processes and sensing and detection applications involving nonpolar materials.
Several potential designs for refractive index sensors in the terahertz regime exist, including photonic crystal waveguides 3, asymmetric split-ring resonators 4, and photonic band gap structures integrated into parallel-plate waveguides 5. Many of these designs are based on optical resonators such as rings or cavities. The resonant frequencies of these structures are dependent on the refractive index of the material in or around the resonator. By monitoring the shifts in resonant frequency the refractive index of a sample can be accurately measured and this in turn can be used to identify a material, monitor contamination or dilution, etc.
The sensor design we use here is based on a simple parallel-plate waveguide 6,7. A rectangular groove machined into one face acts as a resonant cavity (Figures 1 and 2). When terahertz radiation is coupled into the waveguide and propagates in the lowest-order transverse-electric (TE1) mode, the result is a single strong resonant feature with a tunable resonant frequency that is dependent on the geometry of the groove 6,8. This groove can be filled with nonpolar liquid microfluidic samples which cause a shift in the observed resonant frequency that depends on the amount of liquid in the groove and its refractive index 9.
Our technique has an advantage over other terahertz techniques in its simplicity, both in fabrication and implementation, since the procedure can be accomplished with standard laboratory equipment without the need for a clean room or any special fabrication or experimental techniques. It can also be easily expanded to multichannel operation by the incorporation of multiple grooves 10. In this video we will describe our complete experimental procedure, from the design of the sensor to the data analysis and determination of the sample refractive index.

The procedure for implementing a refractive index sensor for terahertz frequencies based on a grooved parallel-plate waveguide geometry is described here. The method yields a measurement of the refractive index of a small volume of liquid through monitoring of the shift in the resonant frequency of the waveguide structure

平行平板導波センサを用いたテラヘルツマイクロ流体センシング

Refractive index (RI) sensing is a powerful noninvasive and label-free sensing technique for the identification, detection and monitoring of microfluidic ...

Fabrication And Characterization Of Photonic Crystal Slow Light Waveguides And Cavities

Slow light has been one of the hot topics in the photonics community in the past decade, generating great interest both from a fundamental point of view and for its considerable potential for practical applications. Slow light photonic crystal waveguides, in particular, have played a major part and have been successfully employed for delaying optical signals1-4 and the enhancement of both linear5-7 and nonlinear devices.8-11
Photonic crystal cavities achieve similar effects to that of slow light waveguides, but over a reduced band-width. These cavities offer high Q-factor/volume ratio, for the realization of optically12 and electrically13 pumped ultra-low threshold lasers and the enhancement of nonlinear effects.14-16 Furthermore, passive filters17 and modulators18-19 have been demonstrated, exhibiting ultra-narrow line-width, high free-spectral range and record values of low energy consumption.
To attain these exciting results, a robust repeatable fabrication protocol must be developed. In this paper we take an in-depth look at our fabrication protocol which employs electron-beam lithography for the definition of photonic crystal patterns and uses wet and dry etching techniques. Our optimised fabrication recipe results in photonic crystals that do not suffer from vertical asymmetry and exhibit very good edge-wall roughness. We discuss the results of varying the etching parameters and the detrimental effects that they can have on a device, leading to a diagnostic route that can be taken to identify and eliminate similar issues.
The key to evaluating slow light waveguides is the passive characterization of transmission and group index spectra. Various methods have been reported, most notably resolving the Fabry-Perot fringes of the transmission spectrum20-21 and interferometric techniques.22-25 Here, we describe a direct, broadband measurement technique combining spectral interferometry with Fourier transform analysis.26 Our method stands out for its simplicity and power, as we can characterise a bare photonic crystal with access waveguides, without need for on-chip interference components, and the setup only consists of a Mach-Zehnder interferometer, with no need for moving parts and delay scans.
When characterising photonic crystal cavities, techniques involving internal sources21 or external waveguides directly coupled to the cavity27 impact on the performance of the cavity itself, thereby distorting the measurement. Here, we describe a novel and non-intrusive technique that makes use of a cross-polarised probe beam and is known as resonant scattering (RS), where the probe is coupled out-of plane into the cavity through an objective. The technique was first demonstrated by McCutcheon et al.28 and further developed by Galli et al.29

Use of photonic crystal slow light waveguides and cavities has been widely adopted by the photonics community in many differing applications. Therefore fabrication and characterization of these devices are of great interest. This paper outlines our fabrication technique and two optical characterization methods, namely: interferometric (waveguides) and resonant scattering (cavities).

フォトニック結晶スローライト導波路とキャビティの作製と評価

Slow light has been one of the hot topics in the photonics community in the past decade, generating great interest both from a fundamental point of view ...

Synthesis and Operation of Fluorescent-core Microcavities for Refractometric Sensing

This paper discusses fluorescent core microcavity-based sensors that can operate in a microfluidic analysis setup. These structures are based on the formation of a fluorescent quantum-dot (QD) coating on the channel surface of a conventional microcapillary. Silicon QDs are especially attractive for this application, owing in part to their negligible toxicity compared to the II-VI and II-VI compound QDs, which are legislatively controlled substances in many countries. While the ensemble emission spectrum is broad and featureless, an Si-QD film on the channel wall of a capillary features a set of sharp, narrow peaks in the fluorescence spectrum, corresponding to the electromagnetic resonances for light trapped within the film. The peak wavelength of these resonances is sensitive to the external medium, thus permitting the device to function as a refractometric sensor in which the QDs never come into physical contact with the analyte. The experimental methods associated with the fabrication of the fluorescent-core microcapillaries are discussed in detail, as well as the analysis methods. Finally, a comparison is made between these structures and the more widely investigated liquid-core optical ring resonators, in terms of microfluidic sensing capabilities.

Fluorescent-core microcavity sensors employ a high-index quantum-dot coating in the channel of silica microcapillaries. Changes in the refractive index of fluids pumped into the capillary channel cause shifts in the microcavity fluorescence spectrum that can be used to analyze the channel medium.

Refractometricセンシング用蛍光コアマイクロキャビティの合成と操作

This paper discusses  fluorescent core microcavity-based sensors that can operate in a microfluidic  analysis setup. These structures are based on the ...

Implementation of a Reference Interferometer for Nanodetection

A thermally and mechanically stabilized fiber interferometer suited for examining ultra-high quality factor microcavities is fashioned. After assessing its free spectral range (FSR), the module is put in parallel with a fiber taper-microcavity system and then calibrated through isolating and eliminating random shifts in the laser frequency (i.e. laser jitter noise). To realize the taper-microcavity junction and to maximize the optical power that is transferred to the resonator, a single-mode optical fiber waveguide is pulled. Solutions containing polystyrene nanobeads are then prepared and flown to the microcavity in order to demonstrate the system&#8217;s ability to sense binding to the surface of the microcavity. Data is post-processed via adaptive curve fitting, which allows for high-resolution measurements of the quality factor as well as the plotting of time-dependent parameters, such as resonant wavelength and split frequency shifts. By carefully inspecting steps in the time-domain response and shifting in the frequency-domain response, this instrument can quantify discrete binding events.

A reference interferometer technique, which is designed to remove undesirable laser jitter noise for nanodetection, is utilized for probing an ultra-high quality factor microcavity. Instructions for assembly, setup, and data acquisition are provided, alongside the measurement process for specifying the cavity quality factor.

Nanodetectionのリファレンス干渉計の実装

A thermally and mechanically stabilized fiber interferometer suited for examining ultra-high quality factor microcavities is fashioned. After assessing ...

Stimulated Stokes and Antistokes Raman Scattering in Microspherical Whispering Gallery Mode Resonators

Dielectric microspheres can confine light and sound for a length of time through high quality factor whispering gallery modes (WGM). Glass microspheres can be thought as a store of energy with a huge variety of applications: compact laser sources, highly sensitive biochemical sensors and nonlinear phenomena. A protocol for the fabrication of both the microspheres and coupling system is given. The couplers described here are tapered fibers. Efficient generation of nonlinear phenomena related to third order optical non-linear susceptibility &#935;(3) interactions in triply resonant silica microspheres is presented in this paper. The interactions here reported are: Stimulated Raman Scattering (SRS), and four wave mixing processes comprising Stimulated Anti-stokes Raman Scattering (SARS). A proof of the cavity-enhanced phenomenon is given by the lack of correlation among the pump, signal and idler: a resonant mode has to exist in order to obtain the pair of signal and idler. In the case of hyperparametric oscillations (four wave mixing and stimulated anti-stokes Raman scattering), the modes must fulfill the energy and momentum conservation and, last but not least, have a good spatial overlap.

Efficient generation of nonlinear phenomena related to third order optical non-linear susceptibility &#935;(3) interactions in triply resonant silica microspheres is presented in this paper. The interactions here reported are: Stimulated Raman Scattering (SRS), and four wave mixing processes comprising Stimulated Anti-stokes Raman Scattering (SARS).

微小球ウィスパリングギャラリーモード共振器で刺激ストークスとAntistokesラマン散乱

Dielectric microspheres can confine light and sound for a length of time through high quality factor whispering gallery modes (WGM). Glass microspheres ...

Fabrication of 1-D Photonic Crystal Cavity on a Nanofiber Using Femtosecond Laser-induced Ablation

We present a protocol for fabricating 1-D Photonic Crystal (PhC) cavities on subwavelength-diameter tapered optical fibers, optical nanofibers, using femtosecond laser-induced ablation. We show that thousands of periodic nano-craters are fabricated on an optical nanofiber by irradiating with just a single femtosecond laser pulse. For a typical sample, periodic nano-craters with a period of 350 nm and with diameter gradually varying from 50 - 250 nm over a length of 1 mm are fabricated on a nanofiber with diameter around 450 - 550 nm. A key aspect of such a nanofabrication is that the nanofiber itself acts as a cylindrical lens and focuses the femtosecond laser beam on its shadow surface. Moreover, the single-shot fabrication makes it immune to mechanical instabilities and other fabrication imperfections. Such periodic nano-craters on nanofiber, act as a 1-D PhC and enable strong and broadband reflection while maintaining the high transmission out of the stopband. We also present a method to control the profile of the nano-crater array to fabricate apodized and defect-induced PhC cavities on the nanofiber. The strong confinement of the field, both transverse and longitudinal, in the nanofiber-based PhC cavities and the efficient integration to the fiber networks, may open new possibilities for nanophotonic applications and quantum information science.

We present a protocol for fabricating 1-D photonic crystal cavities on subwavelength diameter silica fibers (optical nanofibers) using femtosecond laser-induced ablation.

フェムト秒レーザー誘起アブレーションを用いたナノファイバー上の1次元フォトニック結晶共振器の作製

We present a protocol for fabricating 1-D Photonic Crystal (PhC) cavities on subwavelength-diameter tapered optical fibers, optical nanofibers, using ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

フォトニックチップを用いたハイスループット全内部反射蛍光と直接確率光学再構成顕微鏡

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

生化学

Fabrication of Refractive-index-matched Devices for Biomedical Microfluidics

The use of microfluidic devices has emerged as a defining tool for biomedical applications. When combined with modern microscopy techniques, these devices can be implemented as part of a robust platform capable of making simultaneous complementary measurements. The primary challenge created by the combination of these two techniques is the mismatch in refractive index between the materials traditionally used to make microfluidic devices and the aqueous solutions typically used in biomedicine. This mismatch can create optical artifacts near the channel or device edges. One solution is to reduce the refractive index of the material used to fabricate the device by using a fluorinated polymer such as MY133-V2000 whose refractive index is similar to that of water (n = 1.33). Here, the construction of a microfluidic device made out of MY133-V2000 using soft lithography techniques is demonstrated, using O2 plasma in conjunction with an acrylic holder to increase the adhesion between the MY133-V2000 fabricated device and the polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. The device is then tested by incubating it filled with cell culture media for 24 h to demonstrate the ability of the device to maintain cell culture conditions during the course of a typical imaging experiment. Finally, quantitative phase microscopy (QPM) is used to measure the distribution of mass within the live adherent cells in the microchannel. This way, the increased precision, enabled by fabricating the device from a low index of refraction polymer such as MY133-V2000 in lieu of traditional soft lithography materials such as PDMS, is demonstrated. Overall, this approach for fabricating microfluidic devices can be readily integrated into existing soft lithography workflows in order to reduce optical artifacts and increase measurement precision.

This protocol describes the fabrication of microfluidic devices from MY133-V2000 to eliminate artifacts that often arise in microchannels due to the mismatching refractive indices between microchannel structures and an aqueous solution. This protocol uses an acrylic holder to compress the encapsulated device, improving adhesion both chemically and mechanically.

生体の屈折率-屈折率整合素子の作製

The use of microfluidic devices has emerged as a defining tool for biomedical applications. When combined with modern microscopy techniques, these devices ...

Fabrication of High-Quality Whispering Gallery Mode Microbubble Resonators

We demonstrate a robust and standardized method for the fabrication of high-quality factor (Q-factor) Whispering Gallery Mode (WGM) Microbubble resonators (MBRs) with a precision glass processing machine (PGP). Microbubble resonators are a unique class of WGM devices with integrated fluidic channels, making them ideal for diverse sensing applications. Herein, we show a standardized protocol to fabricate high-Q microbubble resonators through the optimization of key performance metrics, such as Q-factor and wall thickness. We also show methods to improve the sensitivity of the platform to refractive index changes and other sensing targets through Hydrofluoric acid (HF) wet etching. Lastly, a brief analysis of the resistance of microbubbles to fluid flow is discussed, showing that smaller-diameter microbubbles exhibit greater resistance to flow for analyte delivery - a factor that should be considered for analyte delivery. The implementation of this refined fabrication protocol not only increases the success rate of device production but also reduces fabrication time. Moreover, the protocol can be expanded to other techniques used to produce MBRs, such as CO2 laser-based methods.

Here, we demonstrate a robust and standardized protocol for fabricating high-quality factor (Q-factor) Whispering Gallery Mode (WGM) Microbubble resonators (MBRs) with a precision glass processing machine (PGP).

高品質ウィスパリングギャラリーモードマイクロバブル共振器の作製

We demonstrate a robust and standardized method for the fabrication of high-quality factor (Q-factor) Whispering Gallery Mode (WGM) Microbubble resonators ...