Este protocolo proporciona una técnica para aumentar la eficiencia de la carga de placas de extracción de ADN de 96 pozos, al mismo tiempo que disminuye el riesgo de contaminación cruzada de la muestra. Esta técnica reduce las posibilidades de contaminación durante el primer paso crítico de la extracción de ADN a través de la adición individual de muestras a cada pozo en la placa de 96 pozos. Esta metodología se puede aplicar a cualquiera de los diversos campos de la investigación del microbioma.
Antes de comenzar un experimento, neblina la mesa de sobremesa con 70% de etanol. Después de limpiar, deje que el banco se seque al aire antes de rociar el banco con 10%lejía. Después de limpiar y secar al aire, sumerja las tijeras quirúrgicas microscópicas, espátulas y curvas en un 95% de etanol y exponga las herramientas a una llama.
A continuación, sumerja cada herramienta en 10% de lejía y deje que las herramientas se sequen al aire. Antes del submuestreo, el etanol esteriliza los guantes y homogeneiza a fondo las muestras del suelo. A continuación, asigne un ID de muestra con la ubicación del pozo a cada tubo.
Llene 95 tubos centrífugos de dos mililitros etiquetados con una muestra por tubo, hasta que cada tubo esté aproximadamente medio lleno. El tubo 96 debe utilizarse como una extracción en blanco. Coloque los tubos de submuestra sobre hielo y etiquete 96 tubos de PCR de tapa plana de 200 microlitros estériles de acuerdo con las etiquetas de pozo para una placa de 96 pozos, luego coloque la etiqueta de 200 tubos de microlitro en orden en un bastidor de 96 pozos.
Para preparar una placa de 96 pozos para el experimento, retire la cubierta de la placa y coloque la cubierta en una bolsa de plástico estéril. Cierre la bolsa para evitar la contaminación y cubra la placa con una pieza precortado de película de sellado perforable. A continuación, utilice un rodillo de goma para adherir firmemente el sello a la placa y almacene la placa a cuatro grados centígrados.
Para transferir las submuestras a la placa, coloque 24 de los dos tubos de submuestra mililitros en un bloque de hielo para almacenamiento en frío, y utilice el nombre de la muestra y la hoja de ubicación del pozo para seleccionar los tubos de techo plano correspondientes a 200 microlitros correspondientes. Vortex las submuestras de una en una, durante cinco segundos por muestra para garantizar la homogeneización y cargar aproximadamente 200 microlitros de cada muestra en el tubo PCR correspondiente apropiado. Cuando se hayan cargado las 24 muestras, utilice una toallita de papel empapada blanqueada para limpiar el exterior de un tubo de PCR, e invierta y toque el tubo en el banco para mover la muestra a la parte superior del tubo.
Usando las tijeras esterilizadas y blanqueadas por llama sujetar la parte inferior del tubo PCR para crear una abertura para la muestra, y pasar el tubo sobre la placa con el extremo de corte hacia arriba hasta que se haya alcanzado el pozo apropiado. Incline ligeramente la placa, para facilitar la punción de la película de sellado perforable precortado, y con el tubo directamente por encima del pozo correcto, invierta rápidamente pero cuidadosamente la placa para que la punta cortada encaje en el pozo. Utilice una herramienta esterilizada para tocar la parte superior del tubo hasta que todo el suelo haya caído del tubo hacia el pozo.
Y deje el tubo en el pozo con el plomo cerrado. Cuando todas las muestras se hayan cargado de la misma manera, retire un tubo pcR de tapa plana de 200 microlitros y agregue 750 microlitros de solución de perlas al pozo de la muestra. Coloque el tubo PCR de tapa plana de 200 microlitrotro de nuevo en el pozo empujándolo hacia abajo en el pozo.
Y usa un Sharpie para marcar la parte superior del tubo para indicar que el pozo ha sido cargado. Cuando todos los pozos se han cargado con cuentas devolver los 24 tubos de muestra a 20 grados Celsius almacenamiento y añadir 24 nuevos tubos de submuestra al bloque de hielo, para permitir que el siguiente conjunto de muestras se cargue en la placa de 96 pozos como acaba de demostrar. Cuando los 95 pozos se han cargado con solución de muestra y perla, añadir solución de cordón sólo a la 96a bien.
Retire todos los tubos, pasándolos sólo sobre los pozos cubiertos y retire cuidadosamente la película perforable de la placa. A continuación, transfiera cuidadosamente la cubierta de la placa de la bolsa de plástico a la placa y coloque la placa a 20 grados centígrados hasta la extracción planificada. Una comparación de los métodos de carga de placas muestra que el método demostrado da como resultado la concentración de ADN más baja dentro de los pozos en blanco.
Usando este método, la concentración de ADN fue significativamente menor entonces cuando se utiliza el método propuesto por McPherson et al. Aunque la concentración de ADN por este método no era estadísticamente diferente del método predeterminado qiagen. Los tres métodos producen concentraciones medias de ADN bajo dos nanogramos por microlitro.
Aunque sólo este nuevo método produce pozos sin concentración de ADN medible. Para minimizar el potencial de derrame, mantenga el tubo de 200 microlitros en posición vertical al moverlo sobre la placa, incline la placa e inserte el tubo en el pozo correcto.
